Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 80

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 74 75 76 77 78 79 < 80 > 81 82 83 84 85 86 .. 279 >> Следующая

оптимальные условия (состав среды, pH, время и способ культивирования -
поверхностное или погруженное и т. д.), можно приступать к получению
ферментного препарата. Если фермент выделяется в культуральную жидкость,
его осаждают, если находится внутри клетки, его экстрагируют. Для
разрушения грибных клеток используют различные способы в зависимости от
их прочности: растирание мицелия с измельченным стеклом или песком;
растирание с окисью алюминия (1 : 1); замораживание - оттаивание;
разрушение ультразвуком; обработку растворителями (например, ацетоном).
Y.2.3. ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ [105, 106, 399]
В экстрактах помимо ферментов присутствуют вещества разной молекулярной
массы. Мелкие молекулы удаляют диализом, гель-фильтрацией на сефадексах
g-15, g-25 либо ультрафильтрацией [105, 106, 142, 333, 385]. После этого
в растворе остаются крупные молекулы, преимущественно белки.
Удаление балластных белков и других веществ можно осуществлять изменением
pH среды и нагреванием. При изменении pH среды, особенно в кислую
сторону, происходит кислотная денатурация белков и выпадение их в осадок.
Этим приемом, надо пользоваться с осторожностью, так как возможна
частичная 'денатурация выделяемого фермента.
В случаях, когда получаемый фермент достаточно термостабилен, применяют
метод фракционной денатурации нагреванием. Если раствор прогревать в
течение короткого времени при температуре ниже той, которая вызывает
денатурацию выделяемого белка, то значительная часть балластных белков
денатурируется и выпадает в осадок. При применении специфических
стабилизирующих веществ (например, субстратов, ионов Са2^) температуру
можно повысить на 7-10° выше температуры, при которой происходит
денатурация фермента без стабилизации.
Для удаления небелковых веществ, если они содержатся в ферментной
системе'в виде случайных примесей, применяют разнообразные методы: липиды
удаляют экстракцией растворов ферментов органическими растворителями;
полисахариды - обычно обработкой ами-лолитическими ферментами (без
примесей протеаз); НК - осаждением основным белком (например,
протамином), однако обработка нуклеа-зами более эффективна.
После проведения предварительных этапов дальнейшее выделение и очистка
ферментов заключаются в осаждении белка разными методами и его
фракционировании. Фракционирование всегда сопровождается контрольными
определениями активности фермента, при этом особое внимание уделяют pH и
концентрации электролита, влияние которых на активность ферментов велико.
Для фракционирования в настоящее время пользуются относительно небольшим
количеством стандартных способов, которые описаны ниже.
172
V.2.3.1. ФРАКЦИОННОЕ ОСАЖДЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИМИ
РАСТВОРИТЕЛЯМИ
Один из основных методов очистки белка. Вследствие инактивации
органическими растворителями большинства ферментов этот метод требует
поддержания во время работы низкой температуры. В качестве органических
растворителей используют ацетон, метиловый, изопропиловый, этиловый
спирты. Дать конкретные рекомендации по применению тех или иных реагентов
затруднительно, так как для каждого фермента применение того или иного
растворителя и его концентрация определяются экспериментально.
V.2.3.2. ФРАКЦИОННОЕ ОСАЖДЕНИЕ СОЛЯМИ
Широко применяемый метод. Особенно часто используют химически чистый
сульфат аммония благодаря его высокой растворимости в воде и
стабилизирующему действию на ферменты. При описании методов выделения
ферментов количество сульфата аммония обычно
Рис. 85. Номограмма для вычисления количества сульфата аммония, которое
должно быть добавлено для получения заданного процента насыщения.
выражают в процентах насыщения (например, фракция, осаждаемая при 50%
насыщения) (рис. 85). При фракционировании солями необходимо работать с
одной порцией ферментного раствора, постепенно удаляя каждую предыдущую
фракцию до осаждения последующей и каждый раз увеличивая процент
насыщения сульфатом аммония.
173
V.2.3.3. АДСОРБЦИЯ
Возможны два пути адсорбции: 1) адсорбция фермента (если он
адсорбируется) с его последующей экстракцией или элюцией с адсорбента; 2)
адсорбция балластных веществ из ферментного раствора (если фермент не
адсорбируется).
В настоящее время в качестве адсорбента белков используют главным образом
гели фосфата кальция и гидроокиси алюминия, каолин, силикагель, крахмал,
целлюлозу; для адсорбции нежелательных примесей и пигментов - древесный
уголь. Лучше всего адсорбция происходит в слабокислых растворах при pH 5
- 6 и при нужной концентрации электролита. Ферменты элюируют с адсорбента
слабощелочными растворами буферов. Объем элюирующей жидкости не должен
превышать объема отцентрифугированного геля. Рекомендуется многократная
элюция небольшими порциями элюата.
V.2.3.4. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
В последнее время широкое применение нашли методы очистки ферментов на
ионообменных смолах (ультрафильтрация) и фракционирование смесей,
содержащих белки, фильтрованием через гели "Се-фадекс". Современные
Предыдущая << 1 .. 74 75 76 77 78 79 < 80 > 81 82 83 84 85 86 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed