Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
реакции при концентрации субстрата, равной S; Утах - максимальная
скорость, наблюдаемая в том случае, когда концентрация субстрата
достаточно высока для насыщения фермента; Кт - константа Михаэлиса для
рассматриваемого фермента по отношению к данному субстрату. Имеется
несколько методов графического изображения этого отношения для
определения Km* Мы остановимся только на двух.
1. График зависимости v от [5] представляет отрезок гиперболы. Проекция
точки v - v/2 кривой на абсциссу (рис. 83) соответствует значению S =
/Ст.
2. Модификация уравнения Михаэлиса - Ментен Лайнуивером и Берком основана
на методе двойных обратных величин, т. е. на принципе, что если равны две
какие-либо величины, то равны и обратные величины. В этом случае
уравнение Михаэлиса - Ментен принимает вид (рис. 84): Km (1/S + 1
/vmax)/vmaK4
Откладываем по оси абсцисс значения 1/S, а по оси ординат значение l/v и
строим график зависимости этих величин. Наклон полученной прямой равен
величине Кщ/v; отрезок, отсекаемый прямой на оси
168
ординат,- это 1Л>тах. Продолжая прямую за ось ординат, отсекаем на оси
абсцисс отрезок, равный обратной величине константы Михаэ-лиса-1/Km-
Графические методы определения константы Михаэлиса широко применяют в
ферментологии.
Константа Михаэлиса соответствует концентрации субстрата, при которой
скорость реакции равна половине максимальной, и обычно выражается в молях
на литр. Разные ферменты характеризуются различными значениями Km в
зависимости от начальной и максимальной скоростей реакции. При построении
графиков (любым методом) для определения константы Михаэлиса определяют
скорость реакции при разных значениях концентрации субстрата и
устанавливают значение максимальной скорости реакции г>тах, когда
увеличение концентрации субстрата уже не влияет на скорость реакции.
Константу Михаэлиса следует определять за возможно более короткий
промежуток времени течения ферментативной реакции, используя при этом
достаточно очищенный ферментный препарат.
V.1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
[132, 236, 333, 397, 464]
Изучение ферментативных реакций осуществляют либо путем отбора проб, либо
непрерывными методами. В первом случае через определенные промежутки
времени'отбирают пробы и в результате измерений получают данные, по
которым строят кривые хода реакции. Непрерывные методы заключаются в
проведении большого числа измерений по ходу реакции или в автоматической
регистрации физических и химических показателей.
Для определения ферментов применяют химические, колориметрические,
газометрические, вискозиметрические, хроматографические,
спектроскопические методы,
V.I.6.I. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Многие ферментативные реакции изучают отбором проб через определенные
промежутки времени с последующим определением количества субстрата или
продуктов гидролиза химическими методами (например, определение
неорганического фосфора по Фиске и Суб-бароу). По приросту или убыли
неорганического фосфора определяют активность фосфатазы и фосфорилазы; по
редуцирующей способности с помощью реакции восстановления меди определяют
активность ферментов, действующих на ди- и полисахариды. Для изучения
проте-олитических ферментов широко используют методы формольного
титрования и титрование спиртовой щелочью - метод Вильштеттера* Действие
липаз определяют по количеству образовавшихся жирных кислот в результате
гидролиза сложных эфиров.
V. 1.6.2. ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ [177]
Применение этого метода основано на определении изменения удельного
вращения раствора по мере протекания реакции, так как многие ферменты
действуют только на один из оптических изомеров. Если, например, продукт
реакции оптически не активен, а субстрат активен, то ход реакции можно
проследить по изменению оптического вращения растворов. С аналогичным
положением мы сталкиваемся в том случае,
169
когда субстрат оптически неактивен, но в ходе реакции образуется
оптически активный продукт или же когда субстрат и продукты реакции
оптически активны, но значительно отличаются по величине удельного
вращения.
V.I.6.3. ГАЗОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Большая группа методов определения активности ферментов основана на
количественном учете образующихся в результате реакции >газообразных
продуктов. Эти методы удобны для определения оксидаз ((поглощение 02) или
декарбоксилаз (выделение С02), гидрогеназ, уреаз 1или карбоангидраз, а
также аминогрупп, освобождающихся при ферментативном расщеплении белков и
пептидов - метод Ван-Сляйка (основан на манометрическом определении
газообразного 02, выделяющегося под действием Н202).
Манометрические методы применяют для определения интенсивности дыхания
тканей, мицелия грибов или бактериальных клеток и количественного
исследования ферментативных реакций, сопровождающихся выделением или
поглощением газа.
V.1.6.4. ВИСКОЗИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Основаны на изменении вязкости растворов. Применяются главным образом для
изучения ферментов, действующих на крупные макромолекулы, например белки,
