Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
сравнительно высокой радиоактивности.
II - клетки фиксируют через определенные промежутки времени после
введения метаболита с меченым атомом. В качестве фиксатора рекомендуют
смесь спирта с ледяной уксусной кислотой (3:1, 10- 15 мин).
6*
163
III - готовят препарат к покрытию ядерной эмульсией, обезвоживая его
проводкой через серию спиртов восходящей концентрации.
IV - препараты покрывают эмульсией.
Все остальные процедуры проводят в фотолаборатории (можно использовать
желто-зеленый светофильтр N° 117 или 118 при максимально возможном
удалении от него).
Применяют ядерные эмульсии двух типов: М - мелкозернистая, Р -
крупнозернистая (ГосНИИХИМфотопроект, Москва). Обычно препараты погружают
в расплавленную эмульсию в химическом стакане, установленном в
термостатируемой водяной бане при 37 - 38° С. Эмульсию разбавляют
дистиллированной водой 1 : 1 (37 - 38° С). Затем препараты извлекают,
дают стечь эмульсии и сушат 3-8 ч, складывают в коробки, обвернутые
черной бумагой, и хранят в темном помещении. Экспозицию устанавливают
экспериментально.
V - препараты проявляют аминоловым или метилгидрохиноновым проявителем.
Состав проявителя (г): 2 метола; 75 сульфата натрия безводного или 150
(кристаллического); 8 гидрохинона; 40 карбоната натрия безводного или 100
кристаллического; 5 бромида калия на 1 л воды. Ингредиенты растворяют в
указанной последовательности в дистиллированной воде (40-50° С). Раствор
хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике и перед
употреблением разводят дистиллированной водой в соотношении 1 : 2.
Препараты проявляют в течение 3-4 мин, затем промывают водой, фиксируют в
течение 5-8 мин в 30%-ном растворе тиосульфата натрия. Температура
проявителя и фиксатора не должна превышать 10-20° С, после фиксации
препарат промывают проточной водой в течение 10-15 мин.
VI - отмытые препараты окрашивают в зависимости от цели исследования
цитохимическими красителями, проводят через серию спиртов восходящей
концентрации, затем через карбол - ксилол (2-3 повторности) и заключают в
бальзам. Приготовленные препараты исследуют под микроскопом и определяют
локализацию и содержание меченого элемента в клетке. В последнем случае
необходима стандартизация условий приготовления препаратов: одинаковая
удельная активность и доза меченого предшественника, определенное время
фиксации, обработка одной эмульсией и др. В препаратах подсчитывают число
зерен серебра на единицу площади исследуемой части клетки (ядра,
цитоплазмы) [150].
V. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ГРИБОВ
V.I. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ
Наука о ферментах, или ферментология, является одним из наиболее бурно
развивающихся направлений биохимии. Это объясняется прежде всего ролью,
которую играют ферменты в биологическом обмене веществ, а также все более
интенсивным применением ферментативных препаратов в различных отраслях
народного хозяйства. Реакции, катализируемые ферментами, характеризуются
более низкой энергией активации, чем соответствующие реакции,
катализируемые ионами Н+, ОН- и другими неорганическими и органическими
катализаторами. В среднем ферменты снижают энергию активации на 16 - 18
ккал/моль. Только благодаря тонкой специфичности ферментативных
катализаторов возможны строгая упорядоченность и взаимосвязь реакций,
лежащих в основе обмена веществ.
V.I.I. ТИПЫ СПЕЦИФИЧНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Различают несколько основных типов специфичности ферментов [132, 236,
464].
Абсолютная специфичность: ферменты, катализирующие превращение только
одного субстрата. Например, уреаза расщепляет мочевину на углекислый газ
и амиак; глюкозооксидаза катализирует окисление P-D-глюкозы с
образованием глюконовой кислоты и перекиси водорода.
Групповая специфичность: ферменты, действующие на ряд субстратов или ряд
связей при условии, что в молекуле субстрата присутствуют атомные
группировки определенного типа. Так, все протео-литические ферменты
расщепляют пептидные связи (СО-NH). Однако трипсин гидролизует только те
пептидные связи, карбонильная группа (С-О) которых принадлежит
аминокислотам - аргинину и лизину; химотрипсин предпочтительнее действует
на пептидные связи, образованные карбонильной группой тирозина или
фенилаланина и т. д.
Специфичность по отношению к определенным типам реакций: ферменты с
наименьшей специфичностью, катализирующие определенные типы реакций
независимо от того, какие атомные группировки присутствуют вблизи той
связи в молекуле субстрата, на которую действует фермент. Так, липазы
катализируют гидролиз любых сложных эфиров, включая и липиды. Однако
скорость реакций в некоторой степени зависит от длины углеродной цепи.
165
Стереохимическая специфичность: ферменты, катализирующие превращение
только одного стереоизомера субстрата. Например, лактатде-гидрогеназа
катализирует окисление лишь L-молочной кислоты. Подобной
стереоспецифичностью обладают также глутаматдегидрогеназа, аспарагиназа и
