Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 75

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 69 70 71 72 73 74 < 75 > 76 77 78 79 80 81 .. 279 >> Следующая

в реакционной смеси. Например, при соотношении содержания ингибитора
(малоновой кислоты) к субстрату (сукцинату) 1 : 50 активность
сукцинатдегидрогеназы ингибируется на 50% независимо от абсолютной
концентрации реагентов.
Цианид калия является ингибитором цитохромоксидазы, в его присутствии
проявляется активность сукцинатдегидрогеназы, устойчивой к действию этого
ингибитора. Реакционная смесь для определения активности
сукцинатдегидрогеназы в этом случае состоит из (мкмоль): 3
нейтрализованного цианистого калия; 40 сукцината натрия; 3 фер-рицианида
калия, растворенного в 0,1 мл фосфатного буфера, pH 7,2; объем смеси
доводят до 2,8 мл. В смесь добавляют 0,2 мл экстракта клеток мицелия и
определяют оптическую плотность при 400 нм. Контроль - вода. Единица
активности ингибитора- понижение оптической плотности в единицу времени
при 20° С.
Неконкурентные ингибиторы реагируют не с центром связывания фермента с
субстратом, а с другими участками молекулы фермента. Наиболее известный
пример - неконкурентное ингибирование ионами тяжелых металлов (Cu2+,
Hg2+, Ag2+) SH-групп. В присутствии этих ингибиторов образуются
меркаптидные формы реагентов, связанные с ионами металлов. Ферменты, для
проявления активности которых необходимы ионы определенных металлов
(Fe2^", F3+, Mg2~*~) неконкурентно ингибируются агентами, связывающими
эти ионы. Например, ЭДТА, который связывает ионы магния, является
неконкурентным ингибитором ферментов, активность которых также зависит от
присутствия магния.
Ингибиторы необратимого действия связывают молекулы ферментов или
существенно нарушают их структуру. К ним относятся алки-лирующие вещества
(например, йодацетальдегид), яды нервно-паралитического действия,
некоторые инсектициды, фунгициды, токсины и др.
Применение специфических ингибиторов позволяет определить состав
цитохромной системы клетки: ингибирование активности цитохрома а окисью
углерода снимается видимым светом, цианид и сероводород ингибируют
комплекс цитохром а + а3 и др. [85, 260].
IV.6.3.7. МЕТОД МУТАНТОВ
Для изучения метаболизма на отдельных стадиях развития гриба используют
ауксотрофные, или дефицитные по потребности в определенных экзогенных
соединениях, мутантные формы грибов, а также

мутанты, по процессам метаболизма. Например, мутант Neurospora crassa
[671], у которого блокирован метаболизм пирувата, обладает высокой
активностью ферментов ПФП. Использование мутантов этого же гриба с
нарушением- определенной стадии обмена аминокислот позволяет проследить
разные пути метаболизма последних (см. раздел XIV.2).
IV.6.3.8. МЕТОД РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ
Метод изучения метаболических процессов в клетке. Радиоактивную метку
вводят в молекулу метаболита или его предшественника, не нарушая их
структуру и функции. Меченые вещества-предшественники вносят в
полноценную питательную среду на определенной фазе роста гриба. Затем
определяют количество и локализацию меченого вещества в структурных
компонентах клетки.
В качестве метчиков применяют изотопы фосфора 32Р (изучение обмена
макроэргических соединений, фосфолипидов и других фосфосо-держащих
соединений, НК), углерода 14С (изучение структуры органических
соединений), трития 3Н (выяснение тонкой субклеточной организации
органических соединений). Выбор радиоактивного изотопа определяется
характером изучаемого биохимического процесса. Например, для изучения
синтеза НК применяют меченные по фосфору, углероду или водороду
предшественники - пуриновые и пиримидиновые основания, глюкозу,
нуклеозиды; для определения включения серосодержащих аминокислот
(метионина, цистеина) эти аминокислоты метят по сере.
Опыты проводят в специально оборудованных лабораториях с соблюдением
правил защиты [182].
IV.6.3.9. МЕТОД РАДИОГРАФИИ [150]
Метод основан на регистрации радиоактивного излучения с помощью
фоточувствительных материалов и позволяет: 1) проследить локализацию и
продвижение меченного радиоактивными изотопами предшественника в системе,
включение его в ядро, цитоплазму и другие структуры клетки; 2) обнаружить
радиоактивное соединение при его минимальной концентрации (высокая
чувствительность реакции). Излучение радиоактивных изотопов регистрируют
с помощью специальных эмульсий с повышенным содержанием мелких кристаллов
бромидов серебра с большой плотностью насыщения ими желатина. При
экспонировании на свету происходит реакция, аналогичная фотохимической, в
результате которой образуется восстановленное серебро (скрытое
изображение). При проявлении эмульсии в участках скрытого изображения
образуют скопления гранул восстановленного серебра разных размеров,
различаемые в световом микроскопе.
Обычно используют изотопы 14С и 3Н как элементы, входящие в состав всех
классов органических соединений. Работа с радиоактивными изотопами
предполагает ряд последовательных этапов:
I - в культуральную среду вводят меченный изотопом предшественник
метаболита. Желательно при этом, чтобы доза изотопа была невелика при
Предыдущая << 1 .. 69 70 71 72 73 74 < 75 > 76 77 78 79 80 81 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed