Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
веществами окрашенные соединения, содержание которых определяют
колориметрическими методами.
При цитохимических исследованиях грибной клетки большое значение имеет
выбор метода фиксации препарата, вызывающий наименьшие изменения в
клетке. В качестве фиксаторов используют пары осмиевой кислоты,
формалина, этанола, эфира, применяют также кратковременную термическую
фиксацию на пламени горелки.
Электронно-микроскопическое изучение препаратов субклеточных фракций дает
представление о тонкой структуре клеточных элементов, гомогенности осадка
и составе клеточных структур. Электронно-микроскопический контроль
чистоты фракций и целостности органелл помогает установить взаимосвязь их
структуры и функции.
Химический метод основан на определении специфических соединений
отдельных субклеточных структур. Так, значительное содержание ДНК (более
90%) характерно для фракции ядер, присутствие ДНК в других клеточных
фракциях в значительном количестве указывает на их негомогенность.
Наличие цитохрома С характерно для митохондриальной фракции, цитохрома В5
- для микросомальной.
Иммунологические методы обычно связаны с предварительной иммунизацией
животных. Их применяют для определения чистоты белков [362].
IV.6.3.5. ФЕРМЕНТНЫЕ МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ
Эти методы отличаются специфичностью, быстротой, возможностью
исследования сравнительно малых количеств материала. В основе их лежит
определение активности специфических (индикаторных, маркерных) для
отдельных субклеточных фракций ферментов (табл. 10). По активности
специфических ферментов определяют степень повреждения субклеточных
структур в процессе их выделения или в результате воздействия других
факторов, вызывающих солюбилизацию (выход ферментов из структур). Для
более полной характеристики субклеточных структур определяют активность
нескольких специфических ферментов.
160
Таблица 10. Органеллоспецифические ферменты клеток печени [362]
Субклеточная фракция
Ядерная
Митохондриальная
Лизосомальная
Уратоксидазные частицы Микросомальная
Клеточный сок
Индикаторный фермент
НАД-пирофосфорилаза Су кцин ат деги дрогеназа Цитохромоксидаза Г
лутаматдегидрогеназа Кислая фосфатаза Кислая РНКаза Кислая ДНКаза
Катепсин
Арилсульфатазы А и В
6-Гликозидаза
Уратоксидаза
Оксидазы D-аминокислот
Каталаза
Г люкозо-6-фосфатаза Неспецифическая холинэстераза Антимицин-резистентная
НАДН-цитохром-С-редуктаза Аланинаминотрансфера за Альдолаза
Лактатдегидрогеназа
IV.6.3.6. МЕТОД ИНГИБИТОРОВ
Ингибиторы, или метаболические яды, применяют для изучения метаболизма
веществ. Их действие основано на торможении определенных ферментативных
реакций, синтеза и превращения веществ. Например, флюорид и йодацетат
считаются ингибиторами ЭМП. Но так как многие ферменты начальных стадий
метаболизма являются общими для ЭМП, ПФП и ЦТК, необходимо параллельное
определение продуктов, не участвующих в реакции торможения - иначе трудно
выяснить механизм метаболизма глюкозы и пути его торможения при данных
условиях культивирования. Ингибирование гликолиза флюоридом с накоплением
в реакционной смеси фосфоглицерата свидетельствует о наличии ЭМП, но,
если необходимые для энолазы ионы Mg2+ накапливаются в реакционной смеси
в виде нерастворимого магнийфлюоро-фосфата, можно предположить наличие
ПФП. Некоторые метаболические яды оказывают множественное действие в
зависимости от их концентрации. Так, флюорид блокирует у Asp. terreus -
продуцента итаконовой кислоты - превращение пирувата в итаконовую кислоту
в концентрации, которая слабо или почти не тормозит превращение глюкозы в
пируват. Ингибирующее действие метаболических ядов, следовательно,
зависит от степени устойчивости к ним организма или его способности к
изменению путей метаболизма (переходу от аэробного к анаэробному, или
прямому, пути окисления субстрата) [260, 478].
Специфические ингибиторы применяют для изучения субстратной специфичности
ферментов, механизма их действия, природы функциональных групп (активного
центра) и регуляции ферментативных
6 2-66
161
реакций. Различают ингибиторы необратимого и обратимого действия. С
помощью ингибиторов обратимого действия получают количественные
характеристики ферментативных реакций. Обратимое действие ингибиторов
может быть конкурентным и неконкурентным. В первом случае специфический
субстрат и ингибитор конкурируют за центр связывания в молекуле фермента
(например, конкурентное ингибирование малоновой кислотой
сукцинатдегидрогеназы в реакции дегидрирования янтарной кислоты до
фумаровой в ЦТ К; сукцинатдегидрогена-за - флавопротеид, осуществляющий
дегидрирование при наличии в реакционной смеси соответствующих
акцепторов-цианистого железа, феррицитохрома с и др.). Малоновая кислота
связывается с сукцинат-дегидрогеназой и тем самым делает невозможным
окисление янтарной кислоты. Обратимость этого процесса зависит не от
концентрации веществ, а от соотношения субстратов (сукцината и малоната)
