Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
ускорением до 250 ООО-300 000 g. Скорость осаждения субклеточных структур
в гравитационном поле определяют по уравнению: dx/dt = 2/9 [г2 (dp -
dm)g/r]], где* - расстояние (см), пройденное частицей по направлению
центробежной силы за время t (с); dp - плотность частиц (г/см3); dm -
плотность среды разделения (г/см3); т] - вязкость суспензионной среды
(П); g - гравитационное ускорение (см/с2); г - радиус частицы (см); 2/9 -
поправочный коэффициент для частиц шарообразной формы.
Если dp > dm, частицы седиментируются, если dp < dm-флотируют, при dp =
dm- остаются неподвижными* Константу седиментации, т. е. скорость
осаждения на единицу ускорения центробежной силы, вычисляют по формуле
где 5 - константа седиментации наименьших частиц, полностью се-
диментирующихся при данных условиях; Rmax - расстояние от оси вращения
центрифуги до дна пробирки; #ср = (Rm[n + #max)/2; Rmln - радиус
расстояния от оси вращения центрифуги до средней точки мениска столба
жидкости центрифужной пробирки;
3,9 • 10-5Яср In 5=
Я,
3,9 ¦ 1СГБЯ In
max
Г2 (dp - dm)
SQgCpdT - условия, необходимые для полного осаждения частиц. Для
пересчета в единицы Сведберга (5) полученные значения умножают
на 1013. Если время ускорения и замедления вращения центрифуги
незначительно по сравнению с временем центрифугирования при постоянной
скорости, расчет производят по упрощенным формулам
3,9 • Ю~%р In
R,
max
3,9
?cpf2 (dp dm)
где T - время, необходимое для полного осаждения частиц с радиусом г при
центробежном ускорении gcp. Пользуясь приведенными формулами,
рассчитывают примерные условия осаждения и размеры любого класса
шарообразных частиц, полностью осаждающихся при данных условиях [362].
Разделение субклеточных компонентов достигается увеличением скорости
центрифугирования либо градиента концентраций используемых растворов. В
обоих случаях сначала оседают более тяжелые частицы, затем - более
легкие. При центрифугировании клеточные компоненты распределяются в
пробирке слоями (в соответствии с их плотностью и другими физико-
химическими свойствами) и могут быть отделены для дальнейшего изучения.
При первом центрифугировании (1000-3000g; 10-15 мин) выделяют компоненты
с примерно одинаковой плотностью. Последующее центрифугирование в
градиенте плотности позволяет выделить эти частицы в чистом виде.
Митохондрии грибов осаждаются при скорости центрифугирования 10 000-15
000g в течение 30-60 мин. Несколько раньше осаждается гликоген; липиды
обнаруживают на поверхности надосадочной жидкости.
Фракции частиц разрушенных клеток или клеточных компонентов, осаждающихся
при 10 000-15 000g в течение 15-30 мин, представлены структурами,
видимыми в световом микроскопе. Надосадочная жидкость является
молекулярной фракцией, которая содержит растворимые молекулы сложных
полимеров - белков, НК и др. [362].
Выделенные в результате дифференциального центрифугирования клеточные
органеллы сохраняют свою морфологическую и функциональную целостность.
Современные методы позволяют поддерживать функционирование отдельных
органелл in vitro.
Дифференциальное центрифугирование широко используют для исследования
особенностей цитологии, физиологии и биохимии грибной клетки. Данные,
полученные этим методом, совпадают с данными, полученными при
исследованиях на целых клетках.
IV.6.3.4. СЕДИМЕНТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ И ДРУГИЕ МЕТОДЫ
КОНТРОЛЯ СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ
Седиментационный анализ служит для определения степени гомогенности
субклеточных фракций и необходимости дальнейшего их разделения на
субфракции. Контроль гомогенности субклеточных структур осуществляют
микробиологическими, иммунологическими, химическими и биохимическими
(ферментативными) методами. Для наблю-
159
дения за процессом седиментации и определения границ оседания частиц
разной плотности применяют оптические методы - нефелометрию,
турбидометрию, рефрактометрию и др.
Молекулярную массу частиц определяют методом седиментационно-го
равновесия на ультрацентрифугах, снабженных интерференционными
оптическими системами.
Прежде всего в гомогенате определяют степень разрушения клеток. Наличие
митохондрий в осадке субклеточных структур определяют цитохимическим
методом: например, в суспензию субклеточных структур в 0,25 М растворе
сахарозы добавляют раствор януса зеленого до разведения 1 : 200 00 - 1 :
100 00, осаждают суспензию центрифугированием и через некоторое время
микроскопируют осадок. Митохондрии окрашиваются в розовый цвет и хорошо
видны на фоне остальных элементов клетки, окрашенных в голубой цвет. При
окраске растворами солей тетразолия митохондрии обнаруживаются по наличию
окрашенных нерастворимых гранул формазана.
Цитохимические методы позволяют определить локализацию веществ в
неразрушенной клетке гриба, а в некоторых случаях - в живых клетках. Эти
методы основаны на разном поглощении структурами клетки световых лучей
или способности структурных компонентов образовывать с определенными
