Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
росте гриба на благоприятной среде. При этом учитывают количество
ветвлений и скорость роста боковых гиф, перенос питательных компонентов
от отдельных клеток гифы к растущему ее концу, подавление ветвления или
роста боковых гиф растущим концом главной гифы вследствие, например,
конкуренции sa источник питания, а также морфологические особенности
субстратного и воздушного мицелия и др. (рис. 77).
Плотность гиф определяют их общей длиной, представляющей суммарную длину
главной гифы и ее ответвлений всех порядков, в расчете на единицу
поверхности, реже объема колонии. Плотность определяют в разных участках
растущей части колонии. Для этого 1 мм2 мицелия фиксируют, например,
смесью формалина, уксусной кислоты и этилового спирта, окрашивают
метиленовым синим, трипан-блау в лактофеноле или другой экспериментально
подобранной краской. Поверхность окрашенной периферической части колонии
фотографируют под микроскопом. Длину гиф и их плотность измеряют либо при
проектировании негативной пленки (увеличение до 200), или же
непосредственно на фотографии.
IY.4.2. ИЗМЕРЕНИЕ ПЛОТНОСТИ ГИФ КОЛОНИИ
144
IV.4.3. ИЗМЕРЕНИЕ РАЗМЕРОВ КЛЕТОК ГИФ КОЛОНИИ
Препараты для измерения размеров клеток гиф готовят из воздушного или
субстратного мицелия разного возраста, взятого по радиусу из разных
участков колонии. Под микроскопом определяют длину (расстояние между
двумя перегородками) и ширину клеток главной гифы и ее ветвлений разных
порядков, затем находят соотношения длины и ширины клеток главной гифы и
ее ветвлений разных порядков. В несептированном мицелии измеряют размеры
главной гифы и ее ветвлений разных порядков.
IV.4.4. ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ
И ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ КЛЕТОК ГИФ
РАСТУЩЕЙ КОЛОНИИ
В препаратах мицелия, взятого из разных участков колонии, определяют
наличие живых и мертвых клеток, особенности их морфологии; наличие
хламидоспор, клеток хламидоспорового типа и гигант ских клеток, появление
фрагментов гиф с утолщенными оболочками и т. д. Для характеристики роста
и физиологического состояния гриба препараты фиксируют и окрашивают, а
затем определяют наличие клеточных структур (ядер, митохондрий) и
включений (жира, глико* гена, метахроматина и др.).
IV.4.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РОСТА ПО СУХОЙ МАССЕ
МИЦЕЛИЯ
Сухую массу мицелия, или общую массу гриба, определяют обычно при
культивировании в жидких питательных средах. Для установления
интенсивности роста мицелия сухую массу определяют в динамике в среде
данного состава, а при изучении влияния на рост различных факторов - в
динамике во всех вариантах опытов. Сроки определения сухой массы мицелия
зависят от цели исследований и условий культивирования (1-50 и более
дней). Первое определение роста осуществляют обычно через 6-12 или 18-24
ч после посева, т. е. после полного прорастания конидий. Желательно
сочетать определение интенсивности роста мицелия с комплексным изучением
других свойств гриба и культуральной жидкости.
Перед определением сухой массы мицелий освобождают от культуральной
жидкости фильтрованием или центрифугированием, затем несколько раз
промывают физиологическим раствором и вновь фильтруют или центрифугируют
при 2500-3000 об/мин. Мицелий высушивают в сушильном шкафу при
температуре 105° С до постоянной массы.
При физиолого-биохимических исследованиях мицелия его отделяют от
культуральной жидкости, промывают водой на холоду, центрифугируют в
градуированных пробирках, затем часть мицелия отбирают для исследований,
а часть - для определения сухой массы и последующего пересчета на всю
биомассу.
Рекомендуется параллельно с определением сухой массы мицелия проводить
микроскопические исследования, определять характер роста, наличие
спороношения, количество живых и мертвых клеток, наличие включений в
клетках и др. Проводят многократное микроскопирование средней навески
мицелия (из пробы, предварительно подверг-
из
нутой встряхиванию в шуттель-аппарате) и подсчитывают общее число клеток
в счетных камерах или под микроскопом. На основании этих исследований
судят о процессах морфогенеза гриба, стадиях роста, биосинтетической
активности как общей массы, так и только живых клеток, а также об их
соотношении в растущей культуре.
Культуральная жидкость после отделения на холоду от мицелия может быть
использована для определения наличия ферментов,- токсинов, антибиотиков и
других внеклеточных метаболитов, а также для их выделения различными
методами.
IV.4.6. МЕТОД МИКРОКУЛЬТУРЫ
На внутреннюю сторону верхней крышки стерильной чашки Петри пипеткой
наносят ряды капель жидкой среды Чапека с интервалом до 2 см. Дно нижней
чашки покрывают одним - тремя слоями фильтровальной бумаги и смачивают ее
2-3 мл дистиллированной стерильной воды, не допуская чрезмерного
увлажнения. Среду инокулируют конидиями перед нанесением капель, а при
отсутствии спороношения капли инокулируют мицелием с помощью
микологического крючка. Затем чашкой с фильтровальной бумагой накрывают
