Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
разиновым или стеклянным кольцом с большим количеством мелких отверстий
для распыления струи воздуха или соединена с пористым аэратором [489].
IM.4.2.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ С БАРБОТАЖЕМ ЧЕРЕЗ С(c)ЕДУ ВОЗДУХА
И МЕХАНИЧЕСКИМ ПЕРЕМЕШИВАНИЕМ
Этот метод предполагает использование ферментеров различных конструкций и
емкостей, с перемешивающими устройствами (мешалками) разных типов,
разнообразными способами подачи воздуха и наличием регулирующих
устройств, позволяющих следить за ходом ферментационного процесса (см.
приложение 3).
124
В лабораторных условиях обычно используют ферментеры производства АН
ЧССР, английской фирмы "Галленкамп" и аппараты А К-10 производства СКББП
* АН СССР [477 J; наиболее удобны колонные ферментеры емкостью 1-1000 л
[544].
Этап подготовки посевной культуры аналогичен описаному в разделе II
1.3.4.2. Последующие этапы погруженного культивирования осуществляются по
вариантам II и III (см. рис. 60). Первую генерацию вегетативной культуры
(5-10% объема среды) переносят в лабораторный ферментер и весь процесс
ферментации в зависимости от режима культивирования заканчивается в
течение 72-120 ч (см. рис. 60, вариант И). Этот вариант обычно применяют
в полупроизводственных условиях.
Первую генерацию вегетативной культуры снова переносят в колбы
Эрленмейера для получения второй вегетативной генерации. После
определенного периода выращивания (по достижении требуемой степени роста)
вегетативную культуру переносят в инокулятор или посевной аппарат. Из
посевного аппарата выросшая культура поступает в ферментер (см. рис. 60;
вариант III). В производственных условиях инокуляторы содержат несколько
десятков литров питательной среды, посевные аппараты - от нескольких сот
до нескольких тысяч литров питательной среды, ферментеры -от нескольких
тысяч до нескольких десятков тысяч литров ферментационной среды. Для
примера опишем метод погруженного культивирования Penicillum vitale -
продуцента ферментов глюкозооксидазы и каталазы.
Погруженное культивирование P. vitale осуществляется в две стадии:
1) выращивание вегетативного посевного материала (инокулюма),
2) собственно ферментация.
Получение инокулюма. Среда первая: 2% сахара; 0,2% KN03; 0,6% кукурузного
экстракта (по сухой массе); pH 4,0-4,2.
Колбы емкостью 750 мл, содержащие 200 мл среды, засевают взвесью спор
гриба из расчета (0,6-1,2) • 106 конидий на I мл питательной среды. Для
посева используют 4-8-месячную культуру. Колбы помещают на качалку (240-
260 об/мин); температура культивирования
26-28° С, продолжительность - 36-44 ч. Уровень pH возрастает до 6,8-7,5.
Глюкозооксидазная активность отсутствует, активность каталазы 40-50
ед./мл.
Собственно ферментация (или ведение процесса ферментации). Среда вторая:
8% сахара; 0,8% KN03; 0,1% КН2Р04; 0,05% КС1; 0,05% MgS04; 0,001% FeS04;
pH 6,2-6,6. Стерильную ферментационную среду засевают вегетативным
посевным материалом (4-8% объема среды). Ферментация осуществляется при
26-30° С, давлении 0,2-0,3 атм, непрерывном перемешивании среды мешалкой
со скоростью 270-280 об/мин в течение 72-96 ч. Среду аэрируют
дифференцированной подачей воздуха в ферментер по схеме, приведенной в
табл. 7.
Состав полученной культуральной жидкости: 80-100 ед./мл глюкозооксидазы;
80-200 ед./мл каталазы; 1,5-2,2 г/100 мл среды сахаров (фруктоза); 1,5-
2,2 г/100 мл среды глюконовой кислоты; pH 3,8-4,1.
При производственном получении глюкозооксидазы взвесь спор гриба вносят в
инокулятор, вмещающий до 200 л питательной среды (коэффициент заполнения
0,6). Плотность посева (0,6-1,2) • 10° конидий на 1 мл питательной среды.
Температура выращивания 26-
* Специальное конструкторское бюро биологического приборостроения.
125
28° С, давление 0,2-0,3 атм* Аэрацию осуществляют из расчета 1
объем воздуха на 1 объем среды в минуту при непрерывном перемешивании
среды мешалкой со скоростью 270-280 об/мин в течение 36-44 ч. Для
получения больших количеств посевного материала культуру, выращенную в
инокуляторе, переносят в посевной аппарат
объемом 1-5 м3 на среду аналогичного состава. После культивирования в
течение 20-24 ч при 26-28° С, давлении 0,2-0,3 атм и аэрации среды из
расчета 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту посевной материал (4-8%
объема среды) переносят в ферментер. Дальнейшая ферментация проходит так
же, как описано выше [86, 249].
Разработаны методы направленного культивирования P. vitale для получения
каталазы, которые осуществляются в две стадии на специально подобранных
средах [326]. Показано, однако, что добавление к питательной среде 0,6%
NaCl и двойного соединения глюкозы с NaCl в качестве источника углерода
позволяет осуществить биосинтез каталазы в одну стадию без
предварительного выращивания посевного материала [10].
Пеногаситель - подсолнечное масло: первая порция (0,05 - 0,1% объема
среды) задается одновременно с посевным материалом, следующие порции
(0,05%) вводят по мере образования пены в среде* При этом используют
