Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
среды). После того как среда застынет, чашки переносят в термостат для
выращивания гриба. Можно строго определенный объем взвеси конидий (0,1-1
мл) внести пипеткой в стерильную чашку Петри, а затем влить в нее 15-20
мл расплавленной и охлажденной до 40-50° С агаризо-ванной среды и
равномерно распределить по дну чашки.
В настоящее время разработан аппарат для стерильного автоматического
заполнения чашек Петри средой (рис. 59), который обеспечивает не только
автоматизированный разлив среды, но и автоматизацию всего цикла (подачу
чашек, снятие с них крышек, внесение среды и т. д.).
Первичный посев исследуемого материала производят обычно в чашках Петри,
при этом пользуются петлей, микологическим крючком или пипеткой в
зависимости от консистенции материала.
Возможны два варианта посева на плотную питательную среду в матрасы: а)
на застывшую среду; б) в расплавленную и охлажденную до 40-45° С
агаризованную среду. В первом случае в матрасы разливают по 150-200 мл
среды, стерилизуют и кладут матрас с еще не застывшей средой так, чтобы
она покрыла всю широкую боковую поверхность матраса, не касаясь ватной
пробки. После застывания среды, соблюдая правила стерильности, над
пламенем газовой горелки в матрас на поверхность застывшей среды вводят
питеткой 5-10 мл культуры гриба и равномерно распределяют ее, покачивая
матрас. Засеянные матрасы оставляют на некоторое время для лучшего
впитывания в среду внесенной культуры и затем переносят в термостат.
120
Во втором случае разлитую по флаконам и колбам среду после расплавления и
охлаждения засевают культурой гриба, 100-200 мл среды переносят в
стерильный матрас и распределяют равномерно вдоль его широкой боковой
поверхности. После застывания среды матрас переносят в термостат.
Перед посевом в жидкую питательную среду в матрасы готовят взвесь конидий
встряхиванием культуры гриба в стерильной водопроводной воде (на одну
пробирку с культурой гриба, выращенной на просе
1r- - [Г 4
-J a JP===iJ t=u
,x О 1 UN у
i /Г
S
Рис. 59. Аппарат для разлива питательной среды в чашки Петри [48]:
а - исходная позиция; б - чашка подана в разливочный узел и верхняя
крышка (2) приподнята; 3,4 - чашки, поступающие из бункера прибора; 1 -
чашка, заполненная средой.
(8-10 г проса), добавляют 60-70 мл стерильной воды, на культуру гриба на
косом агаре в обычной пробирке добавляют 5 мл стерильной воды)
Подсчитывают количество конидий в 1 мл взвеси в счетной камере
Предтеченского и засевают их в матрасы с 200-300 мл питательной среды или
в большие бутыли, из которых в стерильных условиях разливают засеянную
среду в матрасы в том же количестве. Чем тоньше слой среды, тем
благоприятнее условия для окислительных процессов и накопления продуктов
метаболизма. Матрасы помещают в термостат в слегка наклонном положении,
чтобы пробка оставалась сухой.
Для культивирования мукоровых и гифальных грибов на твердых
предварительно измельченных парафинах при наличии водной минеральной
питательной среды используют виды с высоким температурным оптимумом (42-
56° С) - Aspergillus oryzae, Asp. niger, Mucor pusil-lus, Rhizopus
oryzae, Absidia corymbifera, A. ramosa, M. hiemalis,
121
M. racemosus, М. circinelloides. Для выращивания грибов используют
минеральную среду Чапека (г): 2NaN03; 1КН2Р04; 0,5MgSO4 • 7Н20; 0,5КС1;
10 мг Fe2 (S04)3 • 7Н20; до 1 л дистиллированной воды, pH среды 5,2. По
500 мл среды разливают в колбы Эрленмейера емкостью 0,75 л и стерилизуют
при давлении 0,5 атм в течение 20 мин. После стерилизации в колбы над
пламенем горелки добавляют отдельно перетопленный, взвешенный и
измельченный до порошкообразного состояния парафин (4 г на 500 мл среды).
Парафин вводят двумя порциями: во время посева грибов и на 2-3-й день
культивирования. Среду засевают культурами, выращенными на сусловом
агаре. Плотность посева 6 • 10*?-1 • 107 конидий на 1 мл среды.
В зависимости от вида культивируемого гриба посевной материал выращивают
в течение 48 ч при температуре 45; 52 и 56° С. Выращенный посевной
материал переносят в ферментационные колбы из расчета 5-10% объема среды.
В процессе ферментации в зависимости от требований, предъявляемых к
получаемому продукту, можно регулировать уровень pH (который обычно
повышают от 5,2-5,5 до 6,5- 7,5) КОН, NaOH или аммиаком. Для ускорения
процесса используют стимуляторы роста - дрожжевой автолизат, экстракт
липидов и др.
Продолжительность культивирования 7-9 дней. После окончания ферментации
культуральную жидкость с выращенным грибом центрифугируют для отделения
неиспользованного парафина. Затем жидкость сливают, а мицелий промывают
на капроновом фильтре водой, нагретой до 50-60° С. Для полного удаления
парафина на фильтре мицелий промывают гексаном. Если при культивировании
используют парафиновый гач, то промывать мицелий лучше метилэтилкетоном
или метил азобутил кетоном.
При поверхностном культивировании по 300 мл среды разливают в матрасы
