Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Выбор метода культивирования зависит от цели исследования. Условно все
методы можно разделить на две большие группы: 1) поверхностное
(стационарные культуры); 2) погруженное, или глубинное, которое включает:
а) периодическое (прерывное, статическое) и б) непрерывное
(непрерывнопроточное, динамическое). Различные варианты этих методов
отличаются аппаратурным оформлением и условиями культивирования.
111.4.1. ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
Методы поверхностного культивирования заключаются в выращивании грибов на
плотных неагаризованных средах (семенах злаковых растений, отрубях,
древесных стружках или опилках и др.), на стандартных агаризованных
средах, разлитых в пробирки, чашки Петри, матрасы, кюветы и т. п., на
жидких питательных средах, разлитых в колбы, матрасы и флаконы различной
емкости.
Техника посева зависит от консистенции питательной среды, качества
высеваемого материала и цели исследования.
111.4.1.1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ НА ПЛОТНЫХ НЕАГАРИЗОВАННЫХ СРЕДАХ
Семена злаковых растений, отруби, овсяная крупа, овощи (картофель,
свекла) и другие естественные продукты являются прекрасным питательным
субстратом для выращивания грибов, позволяющим создать оптимальные
условия для их роста. Семена риса, сорго, арахиса, пшеницы, проса,
размельченной кукурузы в количестве 10-100 г помещают в пробирки, колбы,
матрасы и увлажняют водой (количество воды зависит от вида семян). Так,
для получения афлатоксина из Aspergillus flavus на 50 г семян арахиса
добавляют 12 мл воды, на такую же навеску сорго, пшеницы, риса - 15,
кукурузы - 36, соевых бобов - 18 мл [615]. Вместе с водой можно вносить
дополнительные питательные вещества. Например, для получения афлатоксина
из культуры Asp. flavus (штамм NRRL 3145) на зерне пшеницы и овса к 100 г
семян пшеницы и овса добавляют 50 мл воды и оставляют в колбах
Эрленмейера емкостью 300 мл при комнатной температуре на ночь для
набухания. Затем содержимое колб стерилизуют 20 мин (121° С),
117
охлаждают и засевают суспензией спор из расчета 0,5 мл на 25 г (споры
смывают 6 мл воды с семидневной культуры, выращенной на сусловом агаре
при 25° С). После инокуляции культуру выращивают на качалке при 200
об/мин (28° С) в течение 3 сут. Каждые 24-48 ч в колбы добавляют
стерильную воду из расчета 1 мл на 25 г зерна. На 4-е сут культуру
обрабатывают паром. Целые зерна овса, овсяную крупу и шелуху овса (по 50
г) помещают в колбы Эрленмейера емкостью 300 мл и обрабатывают водой так
же, как пшеницу. Субстрат инокулируют дубликатом суспензии (0,5 мл на 25
г субстрата). Колбы помещают на качалку; добавляют воду через 24, 48, 72
ч; на 6-е сут культуру обрабатывают паром [782].
Для культивирования грибов на отрубях, широко применяемого с целью
получения ряда протеолитических, амилолитических и других ферментов,
используют крупнолопастные пшеничные отруби, содержащие не менее 20%
крахмала с начальной влажностью среды 58-65% *
При культивировании Asp. oryzae на отрубях в кюветах пшеничные или
рисовые отруби увлажняют и пропаривают 1-2 ч для растворения крахмала и
разрушения микроорганизмов, после чего охлаждают до 25-30° С. Охлажденный
субстрат засевают спорами определенного штамма Asp. oryzae (около 0,5%
при пересчете на сухую массу субстрата) и хорошо перемешанную массу
раскладывают в кюветы (желательно с двойным дном) слоем толщиной около
3,75 см и инкубируют при оптимальной для роста гриба температуре (около
30° С). Необходимо поддерживать достаточное увлажнение для предотвращения
высыхания отрубей, а также создавать достаточную вентиляцию для
обеспечения доступа кислорода и удаления углекислоты. Через 40- 48 ч в
массе отрубей накапливается большое количество фермента. Продукт
высушивают при температуре не выше 40° С, пока влажность не снизится до
8% (это предупреждает развитие бактерий), или экстрагируют водой (из
расчета 1-2 объема на каждый объем продукта) и фильтруют [372].
При выращивании Asp. oryzae наблюдается три периода роста: первый -
набухание и прорастание конидий, сопровождающиеся охлаждением среды (для
создания благоприятных условий окружающий воздух необходимо подогревать);
второй (через 12 - 20 ч от момента засева) - интенсивный рост мицелия,
характеризующийся быстрым повышением температуры до 37-47° С (растущую
культуру нужно охлаждать); третий (36-40 ч от момента засева) -
прекращение роста гриба, сопровождающееся снижением температуры ниже 30°
С [489].,
При культивировании грибов на отрубях их засевают спорами и помещают в
горизонтально вращающиеся барабаны разной емкости, через которые медленно
продувают воздух, нагретый до 30° (но не выше 35° С). В период
прорастания спор барабан приводят в движение каждые 2 ч на 15-20 мин, а
затем вращают непрерывно 40-54 ч со скоростью не более 1 об/мин.
Постоянное перемешивание среды и аэрация предотвращают слишком сильное
нагревание культуры, обусловленное выделением тепла при окислении
углеводов и других питательных веществ [450].
