Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
складывают продольными складками ("гармошкой") и помещают в пробирки.
Потом в каждую пробирку добавляют 2-3 мл жидкой среды Чапека или
Гетчинсона без источника углерода и стерилизуют 30 мин при температуре
115° С. Грибы, способные разлагать лигнин, изолируют на питательные среды
с лигнином [307]. Для обнаружения в почве грибов, принимающих участие в
разложении гумуса, к питательным средам прибавляют в качестве источ-
432
ника углерода и азота гумат натрия. Эти же грибы можно выделять и на
почвенный агар - вытяжку почвы с агаром. Для этого необходимое количество
воздушно-сухой измельченной почвы (например, 500 г) заливают водой (1 л),
настаивают сутки периодически взбалтывая, затем кипятят 30 мин и
фильтруют через 1-2 слоя фильтровальной бумаги, после чего
восстанавливают прежний объем жидкости, устанавливают нужный уровень pH
однозамещенным фосфорнокислым калием, добавляют агар-агар (15-20 г),
разливают в посуду и стерилизуют. Грибы, которые могут расти в условиях
дефицита органических веществ, выделяют на голодный агар, который готовят
из расчета 15-20 г агар-агара на 1 л воды. Предложены также питательные
среды, предусматривающие выявление в почве определенных групп грибов.
Так, например, виды Fusarium Link, ex Fr. выделяют на агаризованную
среду, содержащую пентахлорнитробензол (0,5 г на 1 л среды).
В почвах грибы находятся в ассоциациях с другими организмами. Поэтому для
подавления роста некоторой сопутствующей флоры,например бактерий,
питательные среды следует подкислять либо добавлять к ним антибиотики.
Для этих целей используют соляную, серную, лимонную, фосфорную кислоты.
Кислоты к средам добавляют до тех пор, пока pH пробной порции не
достигнет значений 4,2-4,5. Более высокая кислотность может оказывать
угнетающее действие на рост многих грибов. Среды обычно подкисляют перед
добавлением агар-агара. Некоторые кислоты, например лимонную, добавляют
после стерилизации, причем на каждые 5 мл среды прибавляют 1 каплю 50%-
ного раствора кислоты. Кислоты можно заменить бенгальской розовой
(кислотный ксантеновый краситель) в концентрации 1:15 000 [692] или
антибиотиками. Применяют следующую дозировку антибиотиков: 1 000 000 ед.
пенициллина растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды и к
каждому литру питательной среды добавляют 2 мл полученного раствора; 1
000 000 ед. стрептомицина растворяют в 90 мл стерильной дистиллированной
воды, после чего 4 мл раствора прибавляют к 1 л питательной среды.
Антибиотики добавляют к питательным средам после автоклавирования [286].
XIX.1.2.2. МЕТОД ПОЧВЕННЫХ РАЗВЕДЕНИЙ
Грибы изолируют из почв на питательные среды разными методами. Один из
наиболее простых - метод почвенных разведений Ваксмана [824],
заключающийся в посеве почвенной суспензии на питательные среды. Этим
методом пользуется большинство микологов. Анализ микофлоры почв методом
почвенных разведений осуществляют следующим образом. Образцы почв,
отобранные в зоне корневой системы растений (ризосфера) или на участках,
лишенных растительности, просевают через сито с отверстиями диаметром не
более 4 мм между двумя листами стерильной бумаги *. Затем между этими же
листами бумаги смешивают образцы 2-3 проб и быстро готовят среднюю пробу.
Обеспечивая максимум стерильности, смешанную почву взвешивают на
технических весах, обычно по 10 г, в 3-4 повторностях, насыпая ее на
стерильные кружки бумаги шпателем. Для каждого образца берут новый кружок
бумаги, а шпатель обмывают водой, вытирают насухо, погружают в банку со
спиртом и обжигают, проводя через пламя горелки. Навески почвы переносят
в предварительно подписанные стерильные колбы,
* Образцы почь отбирают в стерильные пробирки или бумажные пакеты из
двухслойной пергаментной бумаги.
433
содержащие по 90 мл стерильной воды, и в течение 5 мин встряхивают. Далее
1 мл суспензии переносят из колбы в стерильную пробирку с 9 мл стерильной
воды и слегка взбалтывают. Таким же образом 1 мл суспензии из этой
пробирки переносят в следующую пробирку и т. д. Из пробирки третьего или
четвертого разведения 1 мл суспензии высевают в стерильные чашки Петри
(рис. 128). Посев из каждой пробирки производят в 3 или 4 чашки. Затем в
чашки Петри стерильно (над пламенем горелки) наливают по 10 мл
расплавленной, охлажденной до 40° С агаризованной питательной среды,
после чего ее перемешивают осторожным покачиванием, прежде чем остынет
агар, и ставят в термостат для инку-
Рис. 128. Схема приготовления почвенных разведений и посева почвенных
грибов в чашки Петри:
1 - стерильная бумага с 10 г почвы; 2- колба с 90 мл воды;
3-6 - пробирки с 9 мл воды; 7-10 - чашки Петри с разным разведением
суспензии спор.
бации при температуре 23-25° С на 10-15 сут. Для более полного выявления
видового состава почвенных грибов следует применять несколько различных
агаризованных питательных сред, в том числе и сред, предусматривающих
изолирование определенных экологических групп грибов.
