Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
следующие данные: фамилию врача и адрес учреждения, где обслуживается
больной, фамилию и адрес больного, номер истории болезни, возраст,
профессию; краткие сведения о начале и развитии болезни, результатах
предварительных исследований и предполагаемый диагноз.
393
XVII.3. МИКРОСКОПИЯ ГРИБОВ В НАТИВНЫХ И ОКРАШЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ
XVII.3.1. ПОДГОТОВКА ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Для выявления грибов патологический материал исследуют как неокрашенным
(сухая микроскопия), так и обработанным различными красителями
(иммерсионная микроскопия). Ногтевые и кожные чешуйки, гнойные корочки и
пораженные волоски предварительно размельчают препаровальной иглой на
середине предметного стекла, обрабатывают 30%-ным раствором щелочи (NaOH,
КОН) для мацерации и просветления, слегка подогревают на спиртовке до
появления белого ободка из выпадающих кристаллов и исследуют под
покровным стеклом.
Для ускорения индикации грибов в исследуемых кожных и ногтевых плотных
чешуйках (корочках) применяют метод обогащения, основанный на сочетанном
воздействии более крепких растворов щелочи (40%-ных) и 5-кратного в
течение часа кипячения в центрифужных пробирках. Осадок после
центрифугирования промывают водой и исследуют в капле 10%-ного раствора
КОН под покровным стеклом [361],
XVII.3.2. ОКРАСКА ГРИБОВ ИЗ КОЖНЫХ И НОГТЕВЫХ ПОРАЖЕНИЙ
Для окраски грибов в кожных и ногтевых чешуйках используют синий
лактофенол и уксуснокислую синь (0,05 мл метиленового синего, 3 мл
кристаллической уксусной кислоты, 100 мл во'ды). Для выявления слизистых
капсул грибов на предметное стекло наносят рядом (несоприкасающиеся)
каплю взвеси исследуемых культур в физиологическом растворе и каплю
китайской туши. Затем прокаленной петлей или лопаточкой растирают обе
капли вместе и размазывают краем покровного стекла по предметному.
Препарат фиксируют на пламени и окрашивают карболовым фуксином или
генциановым фиолетовым. На черном фоне видны неокрашивающиеся (белые)
капсулы вокруг окрашенных клеток гриба [200],
XVII.3.3. ОКРАСКА ПО ГРАМУ И ЦИЛЮ - НИЛЬСЕНУ
Окраска по Граму. На фиксированный пламенем мазок жидкого патологического
материала наливают через фильтровальную бумагу анилиновый или карболовый
генциановый фиолетовый на 1 мин, покрывают раствором Люголя (без бумаги)
на 1 мин, погружают для обесцвечивания в 96%-ный этанол на 30 с. Препарат
промывают и докрашивают водным фуксином в течение 1 мин. При этом
грамположительные клетки окрашиваются в фиолетовый, а грамотрицательные -
в красный цвет.
Одновременная окраска по Цилю - Нильсену и Граму. Фиксированный на стекле
над пламенем горелки мазок патологического материала покрывают карболовым
фуксином и выдерживают 15-30 мин при 55° С. Затем промывают водой и 2%-
ным раствором хлоргидрата анилина (несколько секунд); обесцвечивают
погружением в 96%-ный этанол. После этого окрашивают карболовым
генциановым фиолетовым
394
в течение 3 мин, покрывают раствором Люголя на 3 мин, снова промывают
безводным этанолом и докрашивают в течение нескольких секунд 2%-ным
светло-зеленым или пикрининдигокармином.
XVII.3.4. ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗА
Фиксированный спиртом препарат целиком погружают в водный раствор краски
Романовского - Гимза (1-2 капли краски на 1 мл бидистиллированной воды)
на 30-60 мин или дольше в зависимости от густоты мазка. Клетки грибов
окрашиваются в розовато-фиолетовый цвет, хроматиновые включения - в
красный, волютин - в темновато-фиолетовый.
Для выявления грибов используют также окрашивание флуоресцирующими
веществами. Для этого нативные препараты покрывают свежеприготовленным
раствором 20%-ного КОН с 1%-ным раствором акридинового оранжевого (в
соотношении 9:1). Препараты исследуют с помощью флуоресцентного
микроскопа. На синеватом фоне видны зеленовато-желтоватые септированные
нити и бластоспоры. Грибы при этом выявляются довольно быстро;
возможность смешать их с другими структурами невелика.
Различные методы окраски патогенных грибов в тканях описаны в
соответствующих руководствах по микологии и гистологии грибных
заболеваний [459].
XVII.4. ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
Патологический материал, особенно жидкий и биопсированный, следует
высевать как можно быстрее непосредственно после взятия. Для получения
чистых культур грибов необходимо предотвратить бактериальное и плесневое
загрязнение посевов, что достигается подбором соответствующих питательных
сред и оптимальных условий (температуры, влажности, аэрации) для развития
патогенных грибов и получения типичных культур.
Патологический материал и биопсированную ткань предварительно измельчают,
гомогенизируют, растирая в смеси с растворами антибиотиков, выдерживают в
течение 1 ч при комнатной температуре, освобождают фильтрованием через
марлю от крупных частиц и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10
мин. Осадок исследуют микроскопически и вводят подкожно или внутрикожно
мышам (по 0,5 мл) или интратес-тикулярно самцам морских свинок,
