Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
чашек со споровой суспензией последовательно увеличивающимися дозами УФ-
лучей, что достигается увеличением экспозиции. Экспозицию, как и
разведение, подбирают для каждого вида индивидуально. Повторность опытов
трехкратная (и более). Учет выросших колоний производят через промежутки
времени, установленные для каждой культуры индивидуально. Определение
устойчивости к УФ-лучам или искусственному солнечному излучению,
графическое изображение выживаемости облученных грибных объектов (дозные
кривые выживаемости) и их интерпретацию см. в разделе XVI.4.1.
XVI.2.3.4. ОБЛУЧЕНИЕ СПОР В СУХОМ СОСТОЯНИИ
Метод позволяет исключить действие продуктов радиолиза воды на облучаемые
споры.
Приготовленную, как упоминалось выше, водную суспензию спор наносят
градуированной пипеткой по 0,01-0,05 мл на целлофан, сталь-
380
ной диск, желатиновую подложку, целлюлозо-ацетатные или ультра-пористые
фильтры и другие подходящие субстраты и после подсушивания облучают [87,
542, 672]. После облучения находящиеся на подложке споры тщательно
смывают строго определенным количеством воды для получения суспензии
клеток и их посева. Иногда облученные субстраты помещают на дно чашки
Петри и заливают тонким слоем соответствующей питательной среды для
дальнейшего учета выросших колоний. Такая модификация метода имеет много
неточностей, так как скопление облученного материала на небольшом участке
может привести к большому занижению результатов. В особенности это
относится к быстрорастущим гифальным грибам, к которым не применима
методика микроколоний [230].
Разновидность облучения в сухом состоянии - метод экспозиции суспензии
спор [592], которую наносят на поверхность питательной среды и равномерно
распределяют шпателем по всей поверхности облучаемой чашки. Однако в этом
случае возможно некоторое изменение питательной среды в результате
облучения, которое, в свою очередь, может елиять на выживаемость
облученных спор.
Кроме этих основных методов известны методы [557, 666] облучения
предварительно выращенной из стандартизованного инокулюма колонии
соответствующего гриба. При этом можно учитывать изменение морфологии и
интенсивности роста колонии. Указанный метод, пс-видимому, удобен для
биохимического изучения последствий УФ-излу-чения, поскольку облучается
одновременно большое количество нативного материала. Он позволяет
получить также качественную характеристику устойчивости облученного
материала к действию УФ-лучей. Однако, вследствие небольшой проникающей
способности УФ-лучей, этот метод весьма неточен, поскольку не исключено,
что облучению подвергается только поверхностная часть колонии.
Из перечисленных методов облучения подсушенных спор наиболее точным
является метод Ли [672]. В модифицированном варианте метода на
поверхность покровного стекла наносят тонким слоем небольшое количество
расплавленного 20%-ного водного раствора желатина [159]. Желатин
подсушивают на воздухе и на образовавшуюся желатиновую подложку помещают
микропипеткой 0,05 мл водной стандартизованной суспензии спор
соответствующего штамма гриба. Для получения монослоя споровая нагрузка
видов, диаметр спор которых не превышает 8 ммк, составляет 1 " 106
конидий/мл, крупноспоровых видов (диаметр 10 ммк и более) 5 " 10(r).
Полученный таким образом образец после высушивания на воздухе облучают. В
зависимости от условий облучения желатиновую подложку с нанесенной
взвесью спор размещают на покровном стекле или алюминиевой фольге.
Каждый штамм облучают 8-15 последовательно увеличивающимися дозами
излучения (экспозиция от нескольких минут до нескольких часов). Образец с
облученными спорами помещают в пробирку диаметром 30 мм, заливают 5 мл
стерильной дистиллированной воды (разведение 1 : 100). Пробирку,
встряхивая, слегка нагревают над пламенем газовой горелки так, чтобы
желатиновая подложка сошла с поверхности покровного стекла и растворилась
в воде. При этом облученные споры переходят в воду, образуя суспензию,
которую в соответствующих, эмпирически подобранных разведениях высевают в
чашки Петри и заливают теплым агаром. Инкубирование чашек, учет выросших
микроколоний, статистическая обработка данных, повторность опытов
аналогичны описанным в разделе XVI.3. Контролем служит выживаемость
приготовленных таким же образом необлученных сухих спор,
381
Модификация не лишена некоторых неточностей, связанных, главным образом,
с использованием небольшого (0,05 мл) количества споровой суспензии,
однако при соответствующем навыке, аккуратности и точности исполнения
позволяет получить вполне достоверные данные.
XVI.2.3.5. ИЗУЧЕНИЕ ЯВЛЕНИЙ ФОТОРЕАКТИВАЦИИ И ТЕМНОВОЙ РЕПАРАЦИИ ГРИБОВ,
ОБЛУЧЕННЫХ УФ-ЛУЧАМИ (ПО КРИТЕРИЮ ВЫЖИВАЕМОСТИ)
По существующим представлениям [161, 398, 414, 416, 763], устойчивость
микроорганизмов и грибов к облучению обусловлена комплексом факторов,
среди которых основным является способность клеточного генома
восстанавливаться от лучевых поражений. Фотореактивацию у микроорганизмов
