Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Gilman et Abb; 16 - P. roqueforti Thom; 17 - P. sizovae Bagh.; 18 -P.
gor-lenkoanum Bagh.; 19 - P. paxilli Bain.; 20 - рекефертин (алкалоидная
фракция из P. roqueforti): a - проявитель --абсолют-
ный хлороформ, обнаружение реактивом Ван-Урка; б - проявитель -
абсолютный хлороформ - этанол (190 ; 5 по объему), обнаружение реактивом
Ван-Урка L4I
318
XI.4. ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Приведенный выше метод качественного выявления алкалоидов, несмотря на
значительный объем операций, не дает окончательного ответа о их наличии,
так как применяемые реактивы дают положительные реакции со многими
азотсодержащими веществами. Следующий этап оценки способности
микроорганизмов к синтезу алкалоидов предусматривает применение методов
ТСХ [30].
ТСХ проводят на незакрепленном слое окиси алюминия (МРТУ 6-09-2046-64 V
активности по Брокману) и силикагеля (смесь силикагелей L40/100M и LC
5/40М в соотношении 10 : 1), желательно хема-пол или его аналог. Толщина
слоя 0,1-0,2 см, размер пластинок 12 X X 18 или 18 X 25 см (размер
пластинок может быть иным в зависимости от целей исследования). В
качестве проявителей используют в основном две системы: 1) абсолютный
хлороформ; 2) смесь абсолютного хлорофор-
Rf
op
op
0,4
0,2
О
о
о
о
о
•
о
о •
о
о •
о
1,0
0,8 цв
0,4
0,2
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Номер штамма 6
Рис. 114. Оценка содержания алкалоидов в культурах P. restrictum, P.
roqueforti, P. sizovae, P. gorlen-koanum, P. paxill'i (штаммы 15-19) с
помощью реактива Драгендорфа:
а - проявитель - абсолютный хлороформ: # - пятна ярко-оранжевого цвета, О
- пятна светло-оранжевого цвета; б *- проявитель хлороформ -" этанол
(190 ; 5 по объе-
му) 14 ].
319
ма с этанолом (190 : 5 по объему). В связи с тем что алкалоиды относятся
к разнообразным классам химических соединений, число систем проявителей
может быть увеличено, исходя из конкретных задач [15, 481].
Образец, исследуелы! на содержание алкалоидов, растворяют в проявителе и
наносят на хроматографическую бумагу по 500 мкг раствора. Обнаружение
фракций алкалоидов осуществляют с помощью реактива Драгендорфа,
йодплатината калия или реактива Ван-Урка, дающими положительную реакцию с
индольными производными и эргоалкалоидами. При проведении подобной
операции удается показать, что положительная реакция на алкалоиды
обусловлена присутствием в данной пробе не одного, а нескольких
соединений (рис. ИЗ, 114).
XII. ИЗУЧЕНИЕ
ФИТОТОКСИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ
МИКРОСКОПИЧЕСКИХ
ГРИБОВ
Фитотоксинами принято называть продукты обмена микроорганизмов,
подавляющие или задерживающие рост и развитие высших растений.
Фитотоксины представляют собой разнородную в химическом отношении группу
веществ, объединенных по характеру биологического действия.
XII.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КУЛЬТУР МИКРОСКОПИЧЕСКИХ
ГРИБОВ
Для определения фитотоксичности культур микроскопических грибов их
выращивают на жидких питательных средах, чаще всего на синтетической
среде Чапека. Токсичность культуральной жидкости определяют на 7-10-й
день роста при поверхностном и на 5-й день при погруженном
культивировании. Перед определением токсичности культуральную жидкость
отделяют от мицелия фильтрованием.
Если микроскопические грибы плохо растут на искусственных питательных
средах, что чаще всего наблюдается у фитопатогенных грибов, выделенных из
естественных субстратов, целесообразно использовать для развития этих
микроорганизмов природные субстраты (зерно, солому, стебли и т. д.).
Стерильные увлажненные субстраты заражают чистыми культурами грибов и
выращивают в течение 15 дней. Фитотоксические вещества экстрагируют с
помощью растворителей. Полученные экстракты непосредственно или после
упаривания под вакуумом используют для определения фитотоксической
активности. Контролем служат экстракты из субстратов, на которых не росли
грибы.
Для обнаружения фитотоксинов используют биологические, химические и
физические методы. Достаточно объективными и точными могли бы быть
химические и физико-химические методы. Однако сведения о химической
природе токсинов недостаточны для разработки надежной методики. Кроме
того, фитотоксический эффект может быть обусловлен не одним веществом, а
группой веществ (синергидное действие). В таких случаях, даже зная
химический состав смеси, не всегда можно предсказать ее биологическое
действие. Поэтому для обнаружения фитотоксических веществ используют
главным образом растительные тесты, основанные на способности
фитотоксинов задерживать или
п 266
321
подавлять рост растений. Эти методы должны удовлетворять нескольким
требованиям: высокая чувствительность, простота и скорость выполнения.
Ниже приведены наиболее применяемые из них.
XII.1.1. БИОПРОБА НА СЕМЕНАХ РАСТЕНИЙ
Широко распространенный метод [38, 39, 53, 60, 198, 306]. Семена
замачивают в культуральной жидкости в течение 24 ч. Для каждого варианта
берут не менее 50 крупных и 100 мелких семян. Контрольные семена
