Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
удается значительно сократить, меняя режимы выращивания и способ
подготовки посевного материала. Колбы и матрацы засевают 10-суточной
культурой, выращенной на скошенном сусло-агаре.
316
XI.2. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ АЛКАЛОИДОВ
Для качественного анализа содержания алкалоидов используют фильтрат
культуральной жидкости или мицелия. При первичной оценке микроскопических
грибов в качестве продуцентов алкалоидов рекомендуется исследовать
одновременно фильтрат и мицелий.
Последовательность определения. Отфильтрованный мицелий растирают в
фарфоровой ступке с кварцевым песком, объединяют го-могенат с фильтратом
и доводят pH смеси концентрированным аммиаком до 7,5-8,0. При
использовании аммиака редко образуются стойкие эмульсии при последующей
экстракции. Подготовленный таким образом фильтрат культуральный жидкости,
объединенный с гомогена-том мицелия, экстрагируют 3-5 мин в делительной
воронке равным объемом смеси хлороформ - изобутанол (4 : 1). Алкалоиды
извлекают из слоя, содержащего органические растворители, после его
фильтрации для удаления механических примесей 1%-ным раствором серной
кислоты при соотношении объемов (изобутанол-хлороформ) - (серная кислота)
5:1. Кислую водную фазу (первый экстракт), содержащую алкалоиды,
подщелачивают концентрированным аммиаком до pH 7,5- 8,0, вновь
экстрагируют смесью хлороформа и изобутанола в том же соотношении и
переводят алкалоиды в водную фазу добавлением 1%-ного раствора серной
кислоты, как описано выше. Полученный таким образом второй водный
"кислый" экстракт исследуют на содержание алкалоидов. Применение
хлороформа обусловлено тем, что по полноте извлечения известных
алкалоидов он занимает одно из первых мест среди органических
растворителей. Сочетание хлороформа с изопропанолом приводит к
депротеинизации водных растворов. Белок, находящийся в большом количестве
в гомогенате мипелия и фильтрате культуральной жидкости, искажает
результаты качественных реакций осадков на алкалоиды.
Для анализов методом тонкослойной хроматографии можно рекомендовать
несколько иной способ подготовки пробы [30]. Отфильтрованный, многократно
промытый дистиллированной водой мицелий растирают с кварцевым песком до
гомогенного состояния и экстрагируют смесью хлороформ - метанол (1:1 по
объему) и дважды хлороформом. Объединенный хлороформ - метанольный
экстракт подщелачивают 25%-ным раствором аммиака до pH 8,0 и вновь
экстрагируют 3 раза хлороформом. Полученный таким образом экстракт сушат
над безводным сульфатом натрия и удаляют растворитель в вакууме при 30-
40° С, затем экстракт вновь растворяют в хлороформе. Образец готов для
исследования методом тонкослойной хроматографии.
XI.3. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА АЛКАЛОИДЫ
Положительная качественная реакция, строго говоря, является лишь
признаком того, что исследуемый раствор может содержать алкалоид, но не
служит абсолютным доказательством его присутствия. Однако из-за различной
химической природы алкалоидов и разной физиологической активности in vivo
этап качественного осаждения неизбежен. Исключение возможно лишь при
поиске алкалоида (алкалоидов) известной химической природы или
производного какого-либо соединения, для определения которого существует
надежная качественная
317
проба. Например, производные индола при первичном отборе могут быть
идентифицированы с помощью раствора п-диметл аминобенза л ьде-гида,
дающего с ними характерную цветную реакцию.
Групповые осадительные реактивы готовят таким же образом, как и при
анализе растительного сырья на содержание алкалоидов. Рекомендуется
применять реактивы Вагнера, Майера, Зонненшейна и раствор
кремневольфрамовой кислоты [305], реактивы Драгендорфа, Шайблера [473],
образующие комплексы с алкалоидами. О наличии алкалоидов судят по
появлению осадков. Названные реактивы имеют следующие пределы
чувствительности по отношению к известным алкалоидам (мкг/мл): реактив
Майера 2,5-10 ООО; Зонненшейна 1-2000; Вагнера 5-1400; Драгендорфа 3-250;
Шайблера 1-1000; раствор кремневольфрамовой кислоты 2-1000 [473]. По
степени чувствительности к алкалоидам грибов реактивы можно расположить в
ряд: реактив Зонненшейна, реактивы Вагнера и Драгендорфа. Для большей
убедительности рекомендуется ставить с одной и той же пробой не менее
четырех различных реакций.
Rf
0,8
0,8
0Л
0,2
HS 8
ho о
ООО
(r) о о о О
ОООООООО 8 О ° о о о о - о о
ООО
о о о
J L.
0,6
м
0,2
О о о
о о
о О
6 д 10 12 /4
Номер.штамма.
5
16 18 20
Рис. 113. Тонкослойные хроматограммы экстрактов мицелия 19 видов грибов
рода Penicillium:
1 - P. steckii Lab. 2 - P. lanoso-caeruleum Thom.; 3 - P. mar-tensii
Biorge; 4 - P. roseo-purpureum, Dierckx; 5 - P. chryso-genum Thom; 6 - P.
claviforme Bain.; 6 - P. godlewskii Za-leski; 7 - P. raistrickii G.
Smiths; 8 - P. puberulum Bain.; 9 - P. clavifirme Bain.; 10 - P.
canescens Sopp; 11 - P. cyano-ful-vum Biorge; 12 - P. cyclopium Westling;
13- P. pusillum Smith; 14 - P. meleagrinum Biorge; 15 - P. restriction
