Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
притертой пробкой, заливают 100 мл ацетона и экстрагируют при
встряхивании на шут-тель-аппарате в течение 2 ч. Экстракт фильтруют через
бумажный фильтр в фарфоровую чашку (экстракты из кукурузы и проса
фильтруют дважды) и выпаривают досуха под тягой на водяной бане (55- 60°
С). Сухой остаток расстворяют в 5 мл ацетона и переносят его в сосуд с
500 мл воды из аквариума (17-20° С). В раствор помещают 5 гуппи
независимо от пола и возраста. Наблюдение ведут в течение
Таблица 21. Оценка степени токсичности исследуемого корма [244]
Степень токсичности корма Количество погибших гуппи Время
гибели, ч
шт. %
Не токсичен Не более 1 До 20 До 24
I (очень слабо токсичен) 2-3 40-60 12-24
II (слабо токсичен) 4 80 4-8
III (токсичен) 5 100 2-4
IV (резко токсичен) 5 100 1
299
24 ч и отмечают гибель гуппи через 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч (гуппи, вышедших
из опыта, выбраковывают). Время гибели гуппи зависит от токсичности
исследуемого зернофуража (табл. 21) [244]. В качестве контроля используют
1%-ный водный раствор ацетона, в котором гуппи в течение 3 сут остаются
живыми.
X.3.2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА СЕРДЦЕ ЛЯГУШКИ
В этом методе используют культуральную жидкость или экстракт токсина в
разведении 1 : 1000 и 1 : 10 ООО на растворе Рингера - Локка (рабочий
раствор). Минимальные концентрации, действующие на сердце лягушки,- 30-35
мг. Сердце лягушки изолируют по методу Березина. Изменения в деятельности
сердца контролируют кимографом.
При наличии токсических веществ в испытуемом растворе через 7-10 мин
после его введения нарушается ритм работы сердца. Экстракты грибов
фузариум вызывают учащение или замедление ритма сердечных сокращений с
последующей остановкой сердца в диастоле. Экстракты дендродохина в
разведении 1 : 1000 вызывают тахикардию, а затем аритмию [276]. •
X.3.2.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА ЭМБРИОНАХ ПТИЦ
Куриные эмбрионы как биологический тест были применены для изучения
афлатоксинов Blt В2, Glt G2 (отдельно и в смеси), выделенных из
экстрактов арахисовых продуктов и растворенных в пропиленгли-коле,
который не токсичен для куриных эмбрионов. При введении афлатоксина в
желток используют 5-дневные эмбрионы, в воздушную
пугу - 1-дневные, в хорионаллантоисную оболочку - 9-дневные.
Введение экстракта в желток (рис. 109). Делают отверстие в скорлупе над
воздушной пугой и тонкой длинной иглой (под овескопом) вводят в желточный
мешок 0,5 мл исследуемого экстракта с заданной концентрацией афлатоксина.
Затем отверстие заклеивают и лоток с эмбрионами помещают в термостат.
Введение экстракта в воздушную пугу (см. рис. 109). Перед инъекцией
афлатоксина яйца просматривают и карандашом отмечают линию воздушного
мешка, делают отверстие диаметром около 5 мм в скорлупе над воздушным
меищом. До 0,04 мл (или меньше) исследуемого раствора с заданной
концентрацией афлатоксина вносят на мембрану яйца и отверстие заклеивают
пластырем. Эмбрионы инкубируют в термостате при 37° С и 52%-ной
относительной влажности воздуха.
Рис. 109. Введение токсина в воздушный мешок эмбриона:
1 - желток; 2 - амнион; 3 - аллантоисная полость; 4 - воздушное
пространство; 5 - отверстие в скорлупе; 6 - подскорлупная оболочка; 7 -
хорионаллантоисная оболочка; 8 - плод; 9 - белок.
300
Введение афлатоксинов в желток и воздушную пугу вызывает задержку роста и
развития зародыша, гибель которого обычно происходит на 5-10-е сут. Если
зародыш выживает дольше, то он не вылупляется. При вскрытии устанавливают
отечность, кровоизлияния и недоразвитие мозга, пятнистость и
дегенеративные изменения печени, недоразвитие или отсутствие клювика,
укорочение ног, уплотнение перьевого покрова.
ЛД50 афлатоксина Вг при введении в желток - 0,048 мкг, а при введении в
воздушную пугу - 0,025 мкг на яйцо; ЛД100-0,1 мкг.
Введение в хорионаллантоисную оболочку (см. рис. 109). Метод предложен А.
Т. Ивановым (1967 г.). По 0,2 мл исследуемого экстракта заданной
концентрации вводят в хорионаллантоисную оболочку тонкой иглой через
отверстие, которое делают в скорлупе над воздушной пугой, контролируя
правильность введения под овескопом. Для определения гибели зародыша яйца
просматривают под овескопом 2 раза в сутки. Наблюдение за эмбрионами
ведут в течение 21 сут. Биологическое действие микотоксинов определяют по
патологоанатомическим изменениям и выживаемости эмбрионов.
Токсичные экстракты вызывают гибель зародыша через 18 ч после введения.
При этом хорионаллантоисная оболочка утолщена, гипере-мирована, с
точечными и полосчатыми кровоизлияниями; зародыш гиперемирован.
Слаботоксичные экстракты вызывают гибель эмбрионов через 20-25 ч после
введения. Хорионаллантоисная оболочка с точечными кровоизлияниями,
зародыш гиперемирован, внутренние органы дряблые, кровенаполненные,
печень увеличена. Очень слаботоксичные экстракты вызывают гибель
эмбрионов через 30-90 ч после введения. Кровеносные сосуды
хорионаллантоисной оболочки спавшиеся, зародыш гиперемирован, особенно
головка и крылья, печень мраморная, почки кровенаполненные, сердечная
