Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
реакция), в обилии содержащую клетки Bacillus subtilis, вносят парамеции.
Парамеции обычно растут в виде пленок на поверхности у стенок. Парамеции
пересевают на новую среду каждые 1-2 месяца.
297
Можно использовать молочную среду: к 15-20 мл остывшей кипяченой воды
прибавляют 2-3 капли сырого снятого коровьего молока. Развивающиеся
молочнокислые бактерии являются кормом для парамеций. 1-2 раза в месяц к
среде добавляют молоко. Чистые культуры парамеций необходимо постоянно
поддерживать и периодически обновлять.
Последовательность определения. На предметное стекло градуированными
микропипетками наносят две капли экстракта гриба или культуральной
жидкости и 1 каплю жидкости с парамециями. Все три капли должны быть
одинакового объема. Предметное стекло помещают в чашку Петри с
фильтровальной бумагой, смоченной водой (влажная камера). Наблюдение за
поведением парамеций начинают через несколько минут и продолжают не менее
4 ч.
Критерием для определения токсичности служит время гибели парамеций от
воздействия испытуемого экстракта, которую констатируют по полному
прекращению их движения и распаду. При действии экстракта резко токсичных
грибов гибель парамеций наступает через 3 мин, токсичных - 8-20 мин;
слабо токсичных - через 2 ч [243, 420]. Нетоксичные штаммы грибов не
вызывают гибели или каких-либо морфологических изменений парамеций даже
после 24-часового воздействия.
Парамеции проявляют высокую чувствительность к микотоксинам.
X.J.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ
МИКРООРГАНИЗМАХ
При определении токсичности грибов этим методом необходимо соблюдение
правил стандартизации: определенный штамм тест-культуры, среда для
культивирования и испытания, температура культивирования, возраст
культуры микроорганизма, метод испытания (чашечный или титрация), густота
взвеси для посева и др.
Для определения дендродохина в качестве тест-культуры используют Candida
stellatoidea 62, Saccharomyces vini "Ф", выращенные на сусло-агаре. К
афлатоксинам чувствительны Bacillus megaterium и Вас. subtilis; 1 мкг
афлатоксина задерживает рост данных культур через 7 ч после введения. При
использовании триптоглюкозо-дрожже-вого 1%-ного агара, а для газона -
культуры Вас. subtilis, содержащей 1 • 1010 спор/мл [597], патулин
ингибирует рост этой культуры при концентрации 4-8 мкг. Для определения
стахиботриотоксина используют Azotobacter на среде Эшби, фузариотоксина -
Saccharomyces fragilis 25-D на сусло-агаре [47, 127], фумигатотоксина -
культуру Staphylococcus aureus 209 на МПА.
Качественный метод определения микотоксинов основан на образовании зон
ингибиции роста тест-культуры на поверхности газона. Исходные культуры
пересевают не чаще раза в месяц. Для анализа используют суточные
бульонные культуры. Определение токсичности проводят чашечным методом с
помощью бумажных дисков или цилиндриков. Каплю взвеси суточной культуры
тест-микроорганизма тщательно растирают по поверхности агара в чашке
Петри. Затем культуральную жидкость или растворы исследуемого токсина
определенной концентрации (0,01 мл) наносят на бумажные диски или в
цилиндрики, расставленные на агаре с газоном тест-культуры. Чашки с
испытуемыми культурами выдерживают в термостате при температуре,
оптимальной для роста тест-микроорганизма,- 24 ч (если тест-организм -
298
бактерия) и 48 ч (если тест-организм - гриб и дрожжи). При наличии в
испытуемом образце токсина вокруг бумажного диска образуется зона
задержки роста тест-микроорганизма. Методом серийных разведений
определяют количество токсина (антибиотика) не только в условных единицах
разведения, но и в весовых единицах (см. IX. 4.1.). Интенсивность роста
Saccharomyces vini в присутствии дендро-дохина различной концентрации
можно определить нефелометрически. Чувствительность метода - 0,03-0,008
мкг/мл дендродохина [118].
Х.3.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА ЯЙЦАХ МОЛЛЮСКОВ
Токсичность афлатоксина определяют по задержке деления оплодотворенных
яиц моллюска Bankia setaceae. Чувствительность метода - 0,05-40 мкг/мл
афлатоксина. Из гонодальной ткани взрослых особей моллюсков извлекают
яйца и сперму, суспендируют в морской и водопроводной воде, содержащей
различные концентрации афлатоксина, и инкубируют при 10-20° С. В контроле
(без афлатоксина) через 2 ч развивается двуклеточная стадия, через 3-4 ч
- многоклеточная и примерно через 18 - свободно плавающие трихофоры. При
наличии афлатоксина задерживается образование клеточной оболочки, в
результате чего через 3-5 ч развиваются клетки, содержащие несколько
ядер.
Наличие или отсутствие трихофор является критерием действия афлатоксина
[805].
Х.3.2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА РЫБАХ
Для определения афлатоксина в кормах используют яйца и личинки рыбы-зебры
(Brachydanio rerio). Введение 1 мкг/мл афлатоксина вызывает ненормальное
движение личинки через 30 мин и приводит к их гибели через 5-6 ч [496].
Токсичность зернофуража определяют на аквариумных рыбах гуппи. Пробу
зернофуража (50 г) тщательно измельчают, помещают в плоскодонную колбу с
