Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Актиномицины вызывают интерес у биохимиков, связанных с изучением
биосинтеза НК. С этой целью наиболее широко используется антибиотик
актиномицин D, образующий комплексы с гуанином ДНК и тем самым
блокирующий ДНК как матрицу. Поэтому актиномицин D ингибирует ДНК-
полимеразу и ДНК-зависимую РНК-полимеразу [143].
IX.9.3.1. ДЕЙСТВИЕ АКТИНОМИЦИНА D НА ДНК-ПОЛИМЕРАЗУ
КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ
Реакционная смесь содержит (мкмоль) : 0,2 препарата ДНК-по-лимеразы из
клеток кишечной палочки (67-кратной степени очистки); ДНК-матрицу из
тимуса теленка; 4 молекулы нуклеотидтрифос-
Таблица 20. Включение аминокислот в белки в бесклеточной системе кишечной
палочки под влиянием хлоромицетина
Включенная
радиоактив-
ность,
имп/мин
По-
\j-mv.ivna/j аминокислота без хлоромицетина с хлоро- мицети- ном
давление, %
Аланин 124 40 68
Изолейцин 183 31 83
Лейцин 130 50 62
Тирозин 162 38 76
Валин 150 32. 79
284
фата, в том числе Н3-дезоксицитидинтрифосфат, меркаптоэтанол, хлористый
магний, глициновый буфер, 1-30 мкг/мл актиномицина D [395].
Образование РНК на цепях ДНК изучают методом радиоавтографии с помощью
уридина, меченного тритием [104, 114]. Комплементарную РНК выделяют из
реакционной смеси методом хроматографии на колонках, состоящих из ДНК,
закрепленной на целлюлозе или агаре, а также на колонках из фосфата
кальция, метилированного альбумина, полиметакрилата магния, сефадекса, с
последующей градиентной элюцией мочевиной. С этой целью широко применяют
также хроматографию на бумаге и в тонком слое, зонный электрофорез,
электрофорез в крахмальном геле, метод противоточной хроматографии и
фотоэлектроколориметрию [66, 79, 119].
Локализацию НК в отдельных клетках или срезах ткани определяют с помощью
гистохимических и цитохимических методов, включающих окрашивание
различными красителями, специфичными для РНК и ДНК (по Фельгену);
фотографирование в ультрафиолете; ультрафиолетовую микроскопию;
количественную цитофотометрию; инфракрасную спектрофотометрию и др. [79].
IX.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ В ЖИДКОСТЯХ ОРГАНИЗМА И ДРУГИХ СУБСТРАТАХ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Микробиологические методы определения присутствия антибиотиков в
растворах и других субстратах (жидкости организма, биологический
материал) сводятся к определению антибиотической активности их в
отношении чувствительного тест-микроорганизма различ-. ными методами и их
модификациями (метод диффузии в агар, метод серийных разведений и др.
[119]).
В сыворотке крови. Применяют метод диффузии в агар с использованием
чувствительных тест-микроорганизмов (см. IX.4.2). Набирают в пробирку 5
мл крови, соблюдая стерильные условия, и дают ей свернуться. Кровь
центрифугируют, немедленно отсасывают сыворотку и переносят в другую
пробирку. Хранят до применения в камере с сухим льдом или в рефрижераторе
с глубоким замораживанием при температуре -20° С и ниже. Сыворотку вносят
в цилиндрики без разведения или разводят до предполагаемой концентрации в
ней антибиотика 7%-ным раствором бычьего альбумина. Контролем служит
сыворотка крови животных, которым не вводили антибиотик.
В моче. Учитывая, что с мочой выделяется до 20% антибиотика, ее разводят
стерильным физиологическим раствором или фосфатным буфером (pH 6,0) и
испытывают методом диффузии в агар.
В тканях. Для определения антибиотиков в тканях их отделяют, удаляют
остатки крови и фасций путем рассечения и промывания водой. Ткань
взвешивают (сердце, легкое, селезенка, мозг, мышцы) и заливают 1-6
объемами или больше фосфатного буфера (pH 6,0) в зависимости от
предполагаемого содержания антибиотика (масса/объем). Тщательно
гомогенизируют в смесителе. Дают гомогенизату отстояться и исследуют
надосадочную жидкость микробиологическим методом (см. IX,4,2). В качестве
контроля служат органы и ткани неле-
285
ченых животных, так как ингибиторы роста микроорганизмов иногда
присутствуют в нормальных тканях.
В молоке. Испытуемый образец молока вносят в цилиндрики не-разведенным
или разводят нормальным молоком, которое предварительно испытывалось на
отсутствие ингибиторов роста. Определение антибиотиков в молоке проводят
методом диффузии в агар (см. IX.4.2).
В кормах. 10 г образца корма растирают в ступке, помещают в стеклянный
градуированный цилиндр с притертой пробкой и заливают (в зависимости от
предполагаемого антибиотика) различными растворителями. Для определения
пенициллина корма заливают 35 мл фосфатного буфера (pH 6,0), встряхивают
5 мин, дают осадку осесть, декантируют надосадочную жидкость в
центрифужную пробирку. Повторяют эту операцию еще раз и присоединяют
надосадочную жидкость к первому смыву. Определение проводят методом
диффузии в агар.
Пенициллин является единственным из применяющихся антибиотиков,
инактивирующимся специфическим энзимом - пенициллина-зой. Поэтому, для
того чтобы удостовериться, что обнаруженная активность принадлежит
пенициллину, а не другим веществам, вызывающим задержку роста тест-
