Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
буфера, pH 8,5; 15 MgCl2; 5 АДФ; 0,01 мл лактатдегидрогена-зы; 5 НАД • Н;
4 фосфоэнолпирувата; 60 фтористого натрия и 0,2 мл ферментного раствора
[601, 685].
Методики определения активности других ферментов гликолити-ческого пути
можно найти в работах [228, 516, 601, 662, 685].
Ферменты пентозофосфатного пути. Глюкозо-6-фосфатдегидрогена-ва (К.Ф.
1.1.1.49) и 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (К.Ф.1.1.1.44) являются наиболее
характерными ферментами ПФП; реакции, катализируемые ими, НАД "^-
зависимы. Именно эти ферменты определяют окислительную функцию пути в
целом. Для определения активности этих ферментов используют аналогичные
реакционные смеси, состоящие из (мкмоль): 200 Трис-буфера, pH 7,3; 15
MgCl2; 0,5 НАДФ+; 0,2 мл ферментного препарата. В качестве субстратов для
определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-
фосфоглюконатдегидроге-назы используют 4 мкМ глюкозо-6-фосфата и 6-
фосфоглюконата соответственно [228, 270, 601, 685].
Типичными ферментами ПФП являются также транскетолаза и трансальдолаза,
которые осуществляют вторую важную функцию пути - взаимопревращение
сахаров с различным числом углеродных атомов.
Транскетолаза (К.Ф.2.2.1.1). В результате транскетолазной реакции
образуется семи углеродный кетосахар - седогептулозо-7-фосфат и 3-
фосфоглицериновый альдегид. Реакция считается основной для этого фермента
и зависит от тесно связанного с ним ТПФ. Реакционная смесь для
определения активности транскетолазы включает (мкмоль) : 200 Трис-буфера,
pH 7,3; 15 MgCl2; 0,5 НАД • Н; 2,4 ТПФ; 4 рибозо-5-фосфата и 0,2 мл
ферментного препарата. Поскольку активность определяется совокупной
реакцией восстановления диоксиацетон-фосфата, смесь должна также
содержать 1 мкг триозофосфатизомеразы и 9 мкг глицерофосфатдегидрогеназы
[228, 601, 685].
Трансальдолаза (К.Ф.2.2.1.2) действует на продукты транскетолазной
реакции с образованием фруктозо-6-фосфата и эритрозо-4-фосфата.
Реакционная смесь для определения активности этого фермента включает:
0,94 мл 0,04 М триэтаноламин-HCl буфера, pH 7,6;
222
0,2 мл 0,14 М фруктозо-6-фосфата; 0,01 мл 0,01 М НАД • Н; 0,02 мл 0,01 М
эритрозо-4-фосфата; 0,001 мл смеси ферментов: глицерофосфат-дегидрогеназы
и триозофосфатизомеразы (10 мг/мл); 0,2 мл ферментного препарата [228,
796].
Ферменты цикла трикарбоновых кислот. Пировиноградная кислота,
образующаяся в результате пентозофосфатного и гликолитического путей
расщепления углеводов в аэробных условиях подвергается полному окислению
в ряде последовательных реакций, катализируемых цитрат-синтазой,
аконитазой, изоцитрат-, а-кетоглутарат-, сукцинат-и малатдегидрогеназами
и др. Ниже изложены методы определения активности этих ферментов.
Цитрат-синтаза (К.Ф.4.1.3.7). В результате реакции конденсации ацетил-КоА
со ЩУК, катализируемой этим ферментом, образуется лимонная кислота и КоА.
Связывание SH-групп КоА с помощью реактива Эллмана [575] и лежит в основе
метода определения активности цитрат-синтазы. Образующийся меркаптид-КоА
дает характерную абсорбцию при 412 нм (молярный коэффициент экстинкции
этого вещества - 13,6). Реакционная смесь включает (мкмоль): 100 Трис-
буфера, pH 8,5; 0,25 ЩУК; 0,25 ацетил-КоА; 0,1 моль реактива Эллмана; 0,2
мл ферментного препарата [270, 727].
Изоцитратдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.41) катализирует окислительное
декарбоксилирование изолимонной кислоты до а-кетоглутаро-вой и является
регуляторным ферментом для ЦТК. Поскольку фермент НАД^-зависим, то его
активность определяют изменением поглощения кофермента при 340 нм в
прямой реакции. Реакционная смесь включает (мкмоль): 50 Трис-буфера, pH
7,5; 0,25 изоцитрата; 4 НАД"^; 0,5 аденозинмонофосфата; 10 MgCl2; 5
цианида калия; 0,2 мл ферментного препарата. Используя эту смесь, с
помощью приведенной совокупной реькции можно также определить активность
аконитазы (К.Ф.4.2.1.3). Однако в этом случае вместо изолимонной кислоты
в качестве субстрата используют лимонную.
а-/Сетоглутаратдегидрогеназа представляет собой комплекс ферментов,
близких к пируватдегидрогеназному комплексу. Реакционная смесь для
определения активности этого фермента включает (мкмоль) : 200 глицил-
глицинового буфера, pH 8,5; 15 MgCl2;
0,5 НАДФ • Н; 7,8 ЭДТА; 300 аммонийацетата; 4 а-кетоглутарата и 0,2 мл
ферментного препарата [601, 685].
Сукцинат-тиокиназа (К.Ф.6.2.1.5). Реакционная смесь для определения
активности этого фермента включает: 0,1 моль Трис-сукци-натного буфера,
pH 7,4; 0,2 моля MgCl2 в 2 молях КС1; 31 ммоль фосфо-энолпирувата; 4
ммоль НАД • Н; 1 ммоль гуанозинтрифосфата; 1 ммоль КоА; 2 мг/мл
пируваткиназы; 2 мг/мл лактатдегидрогеназы и 0,2 мл ферментного препарата
[787].
Сукцинатдегидрогеназа (К.Ф. 1.3.99.1), катализирующая окисление янтарной
кислоты до фумаровой, является флавопротеидом, в молекуле которого с
белком ковалентно связан ФАД,-^- способный восстанавливаться и затем
отдавать электроны различным неприродным акцепторам, в частности
феррицианиду. Эту особенность фермента используют для определения его
