Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 106

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 279 >> Следующая

ингредиентов реакционной смеси при изучении активности ферментов
различных грибов в значительной степени отличается. Это же в равной мере
касается и значений pH. В связи с этим рекомендуется [617] для
исследуемых организмов проводить уточнение оптимальных значений pH и
количественного соотношения других компонентов среды в предварительных
экспериментах. Используемые в реакционных системах минеральные компонен-
220
ты должны быть максимально очищены от примесей тяжелых металлов, которые
в некоторых случаях могут выступать в качестве ингибиторов ферментов.
Ниже приведены реакционные смеси для спектрофотометрического определения
активности отдельных ферментов рассматриваемых путей превращения
углеводов.
Ферменты гликолитического Пути. Гексокиназа (К.Ф.2.7.1.1). Реакционная
смесь для спектрофотометрического определения гексоки-назной активности
включает (мкмоль) : 200 Трис-буфера, pH 7,3; 15 MgCl2; 0,5 НАДФ^-; 9 АТФ;
6 глюкозы (или другой гексозы); 0,1 глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы; 0,2
мл ферментного препарата. Реакцию начинают добавлением НАДФ^~,
необходимого для дегидрирования образуемого глюкозо-6-фосфата. Необходимо
указать, что гексокиназная активность является общей для ЭМП и ПФП [13,
228, 601].
Фосфоглюкоизомераза (К.Ф.5.3.1.9). Состав реакционной смеси для
определения активности этого фермента включает (мкмоль): 200 Трис-буфера,
pH 7,3; 15 MgCl2; 0,5 НАДФ+; 4 фруктозо-6-фосфата; 7 ед. глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы; 0,2 мл испытуемого ферментного препарата [601, 685,
776].
Фосфофруктокиназа (К.Ф.2.7.1.11) относится к числу регуляторных; ее
активность определяет скорость гликолиза в целом. Для определения
активности фосфофруктокиназы используют смесь, состоящую из (мкмоль) :
200 глицил-глицинового буфера, pH 8,5; 15 MgCl2; 0,5 НАД • Н; 9,45 АТФ;
10 цистеина-НС1; 4 фруктозо-6-фосфата; 0,2 мл ферментного препарата [601,
662, 685, 776]. Поскольку активность этого фермента определяется
совокупной реакцией НАД • Н-зависи-мого восстановления
диоксиацетонфосфата, смесь должна включать также 1 мкг
триозофосфатизомеразы и 9 мкг глицерофосфатдегидро-геназы [506].
Альдолаза (К.Ф.4.1.2.13) -специфический фермент ЭМП; обнаружение его
активности указывает на функционирование гликолитического пути у
исследуемого штамма. Состав опытной смеси для определения альдолазной
активности (мкмоль) : 200 глицил-глицинового буфера, pH 7,3; 15 MgCl2;
0,5 НАД • Н; 4 фруктозо- 1,6-дифосфата; 1 мкг триозофосфатизомеразы и 9
мкг глицерофосфатдегидрогеназы; 0,2 мл ферментного препарата. Пусковым
моментом реакции является добавление фру ктозо-1,6-дифосфата [228, 601,
685, 776].
Триозофосфатизомераза (К.Ф.5.3.1.1). Реакционная смесь для определения
активности этого фермента состоит из (мкмоль) : 200 глицил-глицинового
буфера, pH 8,5; 15 MgCl2; 10 цистеина-НС1; 0,05 НАД • Н; 2
глицеральдегидтрифосфата; 0,02 мл глицерофосфатдегидрогеназы и 0,2 мл
ферментного препарата [516, 601, 685].
Триозофосфатдегидрогеназа (К.Ф.1.2.1.12). О ходе процесса,
катализируемого этим ферментом, судят по восстановлению НАД"*" в прямой
реакции. Для определения активности фермента используют смесь (мкмоль):
200 глицил-глицинового буфера, pH 8,5; 15 MgCl2; 10 цистеина-НС1; 25,5
арсената; 60 фторида натрия; 0,5 НАД+; 3,5 3-фосфоглицеринового
альдегида; 0,2 мл ферментного препарата. В качестве контрольной
используют вторую кювету, содержащую 2,8 мл буферного раствора. Измеряют
начальную абсорбцию при 340 нм, и затем в обе кюветы добавляют 0,2 мл
смеси субстрата и арсената. Из полученных показателей вычитают значение
начальной абсорбции. Эта реакция - один из наиболее важных этапов
гликолиза, который используется также в ПФП. Энергия, освобождаемая при
окислении
221
альдегидной группы 3-фосфоглицеринового альдегида, сохраняется в форме
продукта окисления - 1,3-фосфоглицерата - и освобождается в последующей
реакции при помощи фосфоглицераткиназы [516, 601, 685].
Фосфоглицераткиназа (К.Ф.2.7.2.3). Для определения активности этого
фермента используют реакционную смесь следующего состава (мкмоль) : 200
глицил-глицинового буфера, pH 8,5; 15 MgCl2; 10 ци-стеина-НС1; 13,5 АТФ;
0,5 НАД • Н; 60 фтористого натрия; 4 три-фосфоглицерата; 0,2 мл
испытуемого ферментного препарата [601, 685].
Фосфоглицерому таза (К.Ф.2.7.5.3). Состав реакционной смеси для
определения активности этого фермента включает (мкмоль): 200 глицил-
глицинового буфера, pH 8,5; 15 MgCl2; 5 АДФ; 0,01 мл лактатде-
гидрогеназы; 5 НАД • Н; 4 3-фосфоглицерата; 60 фтористого натрия; 0,2 мл
ферментного препарата [685].
Энолаза (К.Ф.4.2.1.11). Для определения активности этого фермента
используют реакционную смесь, состоящую из (мкмоль): 200 глицил-
глицинового буфера, pH 8,5; 15 MgCl2; 5 АДФ; 0,01 мл лактатдегид-
рогеназы; 5 НАД • Н; 4 2-фосфоглицерата; 60 фтористого натрия и 0,2 мл
ферментного раствора [601, 685].
Пируваткиназа (К.Ф.2.7.1.40). Реакционная смесь для определения
активности этого фермента включает (мкмоль): 200 глицил-глицинового
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed