Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
превращении углеводов, предусматривают ряд последовательных этапов,
включающих культивирование исследуемого штамма, предварительную
подготовку мицелия, его дезинтеграцию, выделение субклеточных фракций или
получение бесклеточных экстрактов и собственно определение активности.
V.10.3.1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГРИБОВ
Культивирование грибов для ферментативных исследований осуществляют одним
из методов, приведенных в разделе III, которые предусматривают строго
контролируемый посев на среды определенного состава и последующее
выращивание в стандартных условиях. Для исследования активности ферментов
углеводного обмена могут быть использованы споры и мицелий. Обычно
исследуют мицелий активно растущей культуры, хотя для изучения активности
в динамике культивирования грибов пригоден мицелий на разных фазах
развития.
V.10.3.2. ПОДГОТОВКА МИЦЕЛИЯ
Подготовка мицелия включает фильтрование и обязательное отмывание его от
культуральной среды. Обычно для этой цели применяют либо минеральную
основу используемой для культивирования среды, либо подходящий буферный
раствор. Растворы, используемые для промывания, предварительно охлаждают
до 2-4° С.
Избыток влаги из отмытого мицелия удаляют, помещая его между двумя слоями
фильтровальной бумаги. После этого его либо измельчают, либо замораживают
в жидком азоте и хранят в холодильном шкафу. В последнем случае мицелий
пригоден для исследования ферментов в течение месяца. Лучшим способом
замораживания мицелия является его прессование между двумя пластинами из
алюминиевой фольги, предварительно охлажденными в жидком азоте. Такая
процедура обеспечивает увеличение поверхности и глубины замораживания
[762, 833].
V.10.3.3. ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ МИЦЕЛИЯ
Разрушение мицелия осуществляют одним из методов, приведенных в разделе
IV.6.3.1. Удобен метод, предложенный в работе [762]. Мицелий гриба
замораживают, погружая в жидкий азот на 5-10 с, и затем тщательно
растирают в течение 20 мин в предварительно охлажденной сухим льдом или
жидким азотом фарфоровой ступке с двукратным (по массе) количеством
отмытого хромовокислой смесью кварцевого песка и одним объемом буфера,
используемого для изучения активности фермента.
219
V.10.3.4. ПОЛУЧЕНИЕ БЕСКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ
Дезинтегрированный мицелий может быть использован либо для выделения
субклеточных фракций методом, приведенным в разделе IV.6.3.2, либо для
получения бесклеточных ферментных препаратов. В последнем случае к
разрушенному мицелию добавляют еще один объем предварительно охлажденного
того же буферного раствора и экстрагируют на холоду с помощью обычного
тканевого гомогенизатора или магнитной мешалки в течение 20 мин.
Бесклеточные ферментные растворы получают путем центрифугирования
суспензии при 30000 g в течение 30 мин на холоду. После удаления
поверхностного маслянистого слоя надосадочную жидкость используют в
качестве ферментных препаратов, которые хранят при температуре 2-4° С.
Такие препараты сохраняют активность в течение нескольких часов, а в
лиофилизированном состоянии - несколько месяцев.
V.10.3.5. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ
Разработано множество методов определения активности ферментов,
катализирующих отдельные реакции процессов углеводного обмена. Наиболее
перспективны спектрофотометрические методы, которые характеризуются
высокой точностью и быстротой выполнения. В основе этих методов лежит
способность некоторых коферментов (НАД, НАДФ) изменять поглощение света с
длиной волны 340 нм в результате окисления или восстановления субстрата,
которое учитывается в прямых или совокупных реакциях. Скорость увеличения
или снижения абсорбции при 340 нм в начальный период реакции обычно
пропорциональна скорости исследуемой ферментативной реакции.
Все компоненты реакционной смеси, за исключением субстрата, соединяют в
кварцевой кювете диаметром 1 см при постоянной температуре (обычно 20 или
25° С) и доводят дистиллированной водой до конечного объема 3 мл (объем
может быть иным). Началом реакции считают момент добавления субстрата в
реакционную смесь. Изменение абсорбции определяют в течение 2-5 мин через
определенные интервалы (15-30 с). Результаты подсчитывают на линейной
части кривой изменения экстинкции. Эндогенную активность определяют в
контрольной пробе (без субстрата) и вычитают из данных опыта.
Специфическую активность фермента выражают в микромолях субстрата,
превращенного за 1 мин 1 мг белка (фермента) и рассчитывают по формуле V
= Edlem, где Е - изменение оптической плотности за 1 мин; d - объем
реакционной системы; е - молярный коэффициент экстинкции (для НАД и НАДФ
составляет 6,22 • 10е см2/моль); т - содержание белка в пробе.
Содержание белка в ферментных препаратах измеряют общепринятыми методами
и задают в реакционную смесь в количестве 1 мг. Однако в зависимости от
активности исследуемых ферментов, а также от других условий содержание
белка в смеси можно изменять. Количественное соотношение отдельных
