Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
может быть алкилирован производным флавина без изменения доступности
участка связывания потенциальных субстратов. Такие модифицированные
флавопапаины использовались для окисления Ы-алкил-1,4-
дигидроникотинамидов, и каталитическая активность некоторых из этих
модифицированных белков была существенно выше, чем у природных
флавопротеин-NADH-дегидрогеназ. Таким образом удалось создать очень
эффективный полусинтетический фермент. Использование флавинов с
высокоактивными, находящимися в определенном положении элек-трон-
оттягивающими заместителями, возможно, позволит разработать эффективные
катализаторы для восстановления никотин-амида.
Крупные успехи, достигнутые за последнее время в химическом синтезе ДНК,
открыли перед белковой инженерией принципиально новые возможности:
конструирование уникальных,,
не встречающихся в природе белков. Для этого необходимо и дальнейшее
развитие технологии, так чтобы изменение генов методами генетической
инженерии приводило к предсказуемым изменениям белков, к улучшению вполне
определенных функциональных их характеристик: числа оборотов, Км для
конкретного субстрата, термостабильности, температурного оптимума.
Химия и технология
183
стабильности и активности в неводных растворителях, субстратной и
реакционной специфичности, потребности в кофакторах, оптимуме pH,
устойчивости к протеазам, аллостерической регуляции, молекулярной массы и
субъединичного строения. Обычно такого улучшения достигали с помощью
мутагенеза и отбора, л в последнее время - путем химической модификации и
иммобилизации. Для успешного конструирования конкретного типа молекул
белка необходимо выявить ряд основополагающих закономерностей,
связывающих структурные особенности белков и их желаемые свойства. Так,
зная точную кристаллическую структуру молекулы изучаемого белка, мы можем
идентифицировать те ее участки, которые следует направленно
модифицировать для увеличения его каталитической активности. Такая
модификация может состоять в изменении аминокислотной последовательности
белка.
Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х
годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на
сульфгидрильную в активном центре протеазы - субтилизина они применили
метод химической модификации. Однако, как выяснилось, такой
тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы
химической модификации не только жестки и неспецифичны; они плохи еще и
тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые
изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены
в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия,
основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при
помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический
мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка,
который интересует исследователя, и встраивают его в подходящий
генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с
желаемой мутацией, последовательность которой из десяти - пятнадцати
нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку
природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную
структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для
начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от
оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка.
Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего
изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой
последовательностью нуклеотидов.
Тирозил-тРНК-синтетаза катализирует реакцию аминоаци-лирования
тирозиновой тРНК, которая включает активирование тирозина с помощью АТР с
образованием тирозиладенилата. Ген этого фермента, выделенный из Bacillus
stearothermophilus,
184
Глава 4
был встроен в бактериофаг М13. Затем каталитические свойства фермента,
особенно его способность связывать субстрат, были изменены путем сайт-
специфической модификации. Так, треонин-51 был заменен на аланин. Это
привело к двукратному увеличению связывания субстрата, видимо, из-за
невозможности образования водородной связи между этим остатком и тирозил-
аденилатом. При замене аланина пролином нарушается конфигурация молекулы
фермента, но способность к связыванию субстрата увеличивается в сто раз,
так как облегчается его взаимодействие с гистидином-48. Сходные сайт-
специфичные изменения, были получены в |3-лактамазе, и обычно они
сопровождались инактивацией фермента. Замена серина-70 на цистеин
приводит к образованию р-тиоллактамазы, константа связывания у которой не
отличается от таковой для природного фермента, но активность по отношению
к пенициллину составляет всего 1-2%.. Тем не менее активность этого
мутантного фермента в отношении некоторых активированных цефалоспоринов
не меньше исходной активности или даже превышает ее; эти белки также
более устойчивы к действию протеаз.
