Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
биосинтеза L-аргинина (рис. 4.5) у Corynebacterium glutamicum
ингибируются по механизму обратной связи самим конечным продуктом, и
образование соответствующих ферментов подавляется L-аргинином. У
цитруллинового ауксотрофа этой бактерии отсутствует фермент, называемый
орнитин-карбамоилтрансферазой, который
Химия и технология
149
Глюкоза
Глутамат д
Перенос
ацетильной
группы ф
*1
N -Ацетиглутамат
-A DP
N -Ацетилглутамилфосфат
Глутамат
у ^\-Ацетилглутамат~
N -Ацетилорнитин #---*------------ семиэльдегид
& -Кетоглутарат Орнитин
Н'арбамилфосфат (орнитин-карбамоилгрансфераза)
if
Цитруллин ^0-" Аргининсукцинат -Аргинин Аспартат, АТР Фу марат
Ингибирование аргинином по механизму обратной связи
Репрессия аргинином по механизму обратной связи
Рис. 4.5. Биосинтез L-аргиника.
катализирует превращение орнитина в цитруллин на одном из промежуточных
этапов биосинтеза L-аргинина. Синтез аргинина не идет, что приводит к
снятию ингибирования по принципу обратной связи со всех ферментов этого
пути и накоплению избытка орнитина. Ауксотрофиые мутанты находят
применение и в тех случаях, когда необходимо синтезировать соединения,
являющиеся конечными продуктами разветвленных цепей метаболических
реакций. Так, L-аспартат является общим предшественником для L-лизина, L-
треонина, L-метионина и L-изолей-цина. Первая реакция в процессе
образования всех этих аминокислот катализируется аспартокиназой,
активность которой может быть ингибирована по механизму обратной связи
при
150
Глава 4
совместном действии L-лизина и L-треонина. У мутантов, аук-сотрофных по
гомосерину или треонину/метионину, существенно снижается внутриклеточная
концентрация L-треонина, что' снимает блокаду с аспартокиназы и позволяет
клеткам накапливать L-лизин.
Получить ауксотрофные мутанты, способные накапливать конечные продукты
неразветвленных цепей биосинтеза, например L-аргинин, невозможно. В таких
случаях приходится отбирать мутанты с частично нарушенной регуляцией
биосинтеза, что позволяет получить повышенный выход конечного продукта.
Такие мутанты известны под названием регуляторных; их отбирают по
устойчивости к аналогам аминокислот или же среди ревертантов ауксотрофов.
В основе использования аналогов аминокислот лежит их сходство с
природными аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект
может быть уменьшен путем добавления соответствующей природной
аминокислоты. Таким образом, аналоги выступают в роли искусственных,
работающих по принципу обратной связи, ингибиторов ферментов,
обеспечивающих биосинтез природных аминокислот, и одновременно подавляют
процесс их включения в белки. Появление мутантов, устойчивых к этим
ложным ингибиторам, означает, что регуляторные ферменты соответствующего
пути обмена становятся у них нечувствительными к аналогу. Так,
серусодержащий аналог лизина 5-(2-аминоэтил)-Ь-цистеин является у
Brevibacterium flavum ложным, действующим по принципу обратной связи
ингибитором аспартокиназы. Устойчивые к его действию мутанты вырабатывают
фермент, который в 150 раз менее чувствителен к ингибированию по
механизму обратной связи, чем фермент исходного штамма, и в результате
продуцируют до 33 г/л лизина. Для увеличения выхода можно воспользоваться
как ауксотрофией, так и дефектами регуляции одновременно. Так, у
Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum сверхпродукции L-
треонина не наблюдается, поскольку происходит сочетанное ингибирование по
механизму обратной связи аспартокиназы и L-треонином, и L-лизином, а L-
треонин ингибирует и гомосериндегидрогеназу. Мутант, устойчивый к аналогу
треонина, а-амино-р-оксивалериановой кислоте, синтезирует в избыточном
количестве треонин, так как ферменты его, ингибированные этой
аминокислотой, десенсибилизированы. Принимающие участие в синтезе
треонина гомо-сериндегидрогеназа и киназа также "выключаются" L-метиони-
ном, и поэтому ауксотрофы по метионину образуют L-треонин с еще большим
выходом.
Регуляторные мутанты можно получить путем трансдукции,, проводя при этом
отбор отдельных мутаций, вызывающих полное рассогласование регуляторных
механизмов, а затем объеди-
Химия и технология
151
,няя эти признаки путем ко-трансдукции. Таким способом у одного штамма
последовательно может быть закреплена устойчивость к нескольким аналогам
(гл. 7).
Производство аминокислот из биосинтетических предшественников
Использование предшественников при производстве аминокислот позволяет
успешно "обходить" метаболический контроль, осуществляющийся по механизму
обратной связи и репрессии. Рассмотрим процесс синтеза L-лейцина из L-
треонина через а-кетобутират. Первый фермент в этом пути биосинтеза,
гидра-таза, у Serratia marcescens ингибируется L-изолейцином по механизму
обратной связи. При добавлении в среду D-треонина происходит индукция D-
треонингидратазы, которая L-изолейцином не ингибируется, и поэтому синтез
L-изолейцина из D-треонина может миновать метаболический контроль. С
