Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
для размножения или же выделения протопластов. Цельные проростки (но не
взятые отдельно листья) давали жизнеспособные протопласты, которые могли
длительное время делиться в культуре.
9.8.3. Методы слияния протопластов
Хотя о возможности слияния протопластов растений было известно уже давно,
метод контролируемого слияния с воспроизводимыми результатами был
разработан лишь в 1970 г. (Power et al., 1970). Тем самым был сделан
первый шаг к соматической гибридизации растений. При суспендировании
протопластов в 0,25 М растворе азотнокислого натрия слияние происходило
очень быстро. Впоследствии для индукции слияния протопластов
Parthenocissus tricuspidata и Petunia hybrida использовали 10,2%-ный
раствор сахарозы, содержащий 5,5% азотнокислого натрия. Для той же цели
применяли хлористый кальций.
Сельское хозяйство и биотехнология 387
Рис. 9.8. Каллусы, образовавшиеся из протопластов Solarium brevidens на
агаре. Снимок сделан примерно через месяц после получения протопластов.
Для выращивания использована чашка Петри диаметром 9 см.
Было показано (Као, Michayluk, 1974), что полиэтиленгли-коль с большой
молекулярной массой также вызывает неспецифическое слипание, а затем и
слияние протопластов растений. При инкубации в самом полиэтиленгликоле
слияний почти не происходило, но при его разведении гибриды образовывали
до 10% протопластов. ПЭГ способствовал также захвату хлоропластов
водоросли Vaucheria dichotoma протопластами моркови. Методы слияния
протопластов подробно описаны в руководстве Пауэра и Дэйви (Power, Davey,
1979).
Получение соматических гибридов
Для осуществления гибридизации соматических клеток методом слияния
протопластов необходимо выполнить следующие операции: 1) выделить
протопласты; 2) осуществить слияние;
3) регенерировать клеточные стенки; 4) осуществить слияние ядер так,
чтобы получить полноценное гибридное ядро; 5) размножить гибридные
клетки; 6) регенерировать целое растение.
Осуществить, слияние протопластов растений, вообще гово-
25*
Рис. 9.9. Регенерация мини-растений Solarium tuberosum из каллусной
ткани, полученной из протопластов (снимок сделан примерно через 100 сут
после перенесения на агаровую среду, способствующую регенерации).
ря, несложно, но из этого не следует, что столь же просто размножить
гибридные клетки или же регенерировать гибридное растение. Прежде всего
нужно отобрать гибридные протопласты, которые составляют лишь малую часть
всех клеток, а затем создать им условия для развития. Примером работы
такого рода может быть эксперимент по соматической гибридизации Petunia
hybrida и Petunia parodii. Здесь отбор был основан на различиях в
способности к росту протопластов из листьев этих двух видов растений.
Дело в том, что протопласты Petunia parodii в использованной в этом опыте
среде могли формировать лишь микрокаллусы, состоящие не более чем из
пятидесяти клеток, в то время как из протопластов Petunia hybrida можно
получать растущие каллусы. Было использовано также и то обстоятельство,
что протопласты Petunia hybrida более чувствительны к актиномицину D, чем
протопласты Petunia parodii.
Гетерокарион, образующийся в результате слияния двух разных протопластов,
может после слияния ядер превратиться в гибридную клетку. Имеется в виду,
что происходит объединение всех несущих гены, самореплицирующихся
органелл обоих про-
Сельское хозяйство и биотехнология
389
Рис. 9.10. Регенерация мини-растений Solarium brevidens из каллусной
ткани, полученной из протопластов (снимок сделан приблизительно через 100
сут после перенесения на агаровую среду, способствующую регенерации).
топластов, в то время как при обычном половом скрещивании от каждой
родительской клетки поступает по ядру, несущему хромосомные гены
(кариомы), но гены, передаваемые с пластидами (пластидомы) и
митохондриями (хондриомы), передаются обычно лишь от женской клетки.
Таким образом, методы на основе слияния протопластов позволяют получать
комбинации двух полных родительских геномов. Слияние протопластов двух
скрещивающихся половым путем видов нередко приводит к образованию
стабильных амфиплоидных гибридных клеток, из которых могут быть
регенерированы растения - соматические гибриды. Надо сказать, что метод
слияния протопластов пригоден для работы не только со столь близкими
видами или гибридными клетками.
Томас и др. (Thomas et al., 1979) перечисляет ряд работ, в которых была
осуществлена регенерация в экспериментах по слиянию протопластов
растений, принадлежащих к одному и тому же (7 случаев) и разным (14
случаев) видам. В четырех экспериментах по межвидовому слиянию были
получены линии клеток, а в четырех других - осуществлен захват клеточных
390
Глава 9
органелл протопластами. В двух опытах в протопласты растений была введена
чужеродная ДНК, которая экспрессировалась, а в трех из протоклонов были
получены мутантные растения. Способы применения метода слияния
протопластов весьма многообразны.
