Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
изменчивости у регенерированных растений картофеля сорта Maris Bard
показало, что она возникает при росте каллусов из генетически
единообразных протопластов и не является следствием экспериментов с
самими протопластами.
Изменчивость протоклонов, наблюдающаяся в отсутствие мутагенов, весьма
важна для растениеводства: благодаря ей селекционер растений получает
богатый исходный материал. Так, среди регенерантов картофеля были
выявлены растения с потенциально полезными признаками: низкорослые, с
измененными клубнями и с разными сроками созревания.
9.8.2. Регенерация растений из протопластов
Шеферд и Тоттен (Shephard, Totten, 1977 г.) в опытах с картофелем, у
которого регенерация растений из культуры тканей затруднена, разработали
метод, позволяющий достаточно успешно регенерировать растения из
протопластов. Их способ был несколько необычным, поскольку предусматривал
особые условия выращивания растений, из которых потом получали
протопласты. Кроме того, на каждой стадии развития растений-реге-нерантов
они применяли особую среду.
Выращивание растений для опытов
Растения картофеля (американский сорт Russet Burbank) выращивали из
клубней, свободных от Х-вируса, при высокой освещенности
(продолжительность светового дня 12 ч), при 24 °С и относительной
влажности 70-75%. Перед началом опыта растения выдерживали 4-10 сут при
той же температуре и влажности, но более слабом (7000 люкс) и менее
продолжительном освещении (6 ч в сутки). Содержание растений в условиях
слабого и непродолжительного освещения приводило к существенному
увеличению выхода жизнеспособных протопластов из тканей листьев (до 2-3-
106 на 1 г ткани).
Среды для выделения и размножения
При выделении и размножении протопластов применяли среды пяти типов (А -
Е), которые представляли собой варианты среды, предложенной Лэмом (Lam,
1975). В их состав входили основные питательные вещества растений,
микроэлементы, ами-
Сельское хозяйство и биотехнология
385
нокислоты, факторы роста, фитогормоны и регуляторы осмотического
давления. Содержание веществ подбиралось так, чтобы обеспечить
оптимальный рост на каждом этапе регенерации. Все среды содержали 1,5-
2,0% агара, кроме полужидкой среды А, где его концентрация составляла
только 0,5%. Среды D и Е, использованные на заключительном этапе,
содержали 1650 мг/л NH4NO3.
Выделение протопластов
4 г ткани, вырезанной из стерилизованных с поверхности молодых листьев,
инкубировали в 200 мл среды А (без сахарозы и агара) в темноте при 4°С в
течение 16-24 ч. Затем среду заменяли на 100 мл забуференного (pH 5,6)
раствора с ферментами, чтобы отделить мезофильные клетки и удалить их
клеточные оболочки. При встряхивании смеси процесс заканчивался за 4 ч
при 28 °С. Жизнеспособные протопласты после процеживания смеси собирали
центрифугированием, промывали средой А, снова осаждали и хранили в жидкой
среде А при концентрации 6-105 клетка/мл.
Рост каллуса
При инкубации протопластов на твердой среде В или на модифицированной
твердой среде происходит регенерация клеточных стенок и ограниченное
деление клеток, в результате чего образуются микрокаллусы. После переноса
в среду С они растут далее до стадии, когда становится возможным перенос
в среду D, где индуцируется образование (морфогенез) побегов. На
заключительной стадии каллусы с побегами длиной около 1 мм переносят на
среду Е для завершения образования побегов и формирования корней.
Укорененные растения пересаживают в небольшие горшочки с вермикулитом,
где они и растут далее.
Здесь изложена суть метода, который следует использовать для регенерации
целых растений из одиночных протопластов, и проиллюстрировано, как
экспериментатору приходится варьировать условия на разных стадиях
развития, чтобы добиться успеха. На рис. 9.7-9.10 показано, как выглядят
свежевыделенные протопласты, молодые каллусы и крошечные растения,
регенерированные из ткани каллуса. Особенно важно в этой работе строго
выдерживать надлежащие условия, однако почти наверняка их придется
специально подбирать для каждого изучаемого вида растений.
Томасу (Thomas, 1981) удалось получить культуры побегов тетраплоидного
картофеля сорта Maris Bard, которые использовались как исходный материал
для выделения протопластов^
25-1344
386
Глава 9
Рис. 9.7, Свежевыделенные протопласты Solanum brevidens.
Пазушные почки стерилизовали с поверхности раствором гипохлорида натрия и
культивировали затем на среде Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962),
содержащей, кроме того, сахарозу (30 г/л), агар (6 г/л) и 6-
бензиламинопурин (6-БАП, 0,5 мг/л), pH 5,8. В ходе инкубации при 26 °С
при освещенности ~400 люкс (16 ч днем, 8 ч ночью) за 3-5 нед
образовывались ростки длиной около 3 см. Их можно было использовать для
дальнейшего размножения на той же среде, но без 6-БАП, для чего брали
короткие (3-8 мм) отрезки стебля с листом и пазушной почкой. Рост
продолжался три недели, после чего побеги можно было опять использовать
