Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
высококачественные препараты на торфяной основе.
9.3.4. Современные инокуляты на твердых носителях
Rhizobium, выращенные на агаре или в жидкой среде, после высушивания на
поверхности семян быстро погибают, да и сами культуры их нежизнестойки.
Этих недостатков лишены инокуляты на торфяной основе, которые были
созданы в США, а сегодня применяются повсеместно.
При получении культуру нужного штамма Rhizobium выращивают обычным
способом в ферментере объемом в несколько литров в жидкой среде
(например, содержащей маннитол и дрожжевой экстракт). Установка может
быть очень несложной, лишь бы ее устройство обеспечивало защиту от
микробного загрязнения. Температуру среды поддерживают в интервале 25-28
°С, и осуществляют интенсивную аэрацию, продувая через среду стерильный
воздух. Контроль за pH осуществлять не
360
Глава 9
нужно, особенно если в среду добавлено немного СаСОз. К моменту
смешивания с торфом (носителем) -стерильным или нестерильным- плотность
культуры должна быть достаточно высокой, 5-10(r)-4• 109 клетка/мл. В случае
медленно растущих штаммов (например, R. lupini) со средним временем
удвоения числа клеток около 10 ч обычно бывает сложно получить культуру с
высокой плотностью, и нередко даже размножение более быстро растущих
штаммов (со средним временем удвоения 3 ч) подавляется видами-
загрязнителями. Для обеспечения быстрого роста культуры на жидкой среде
полезно вносить сразу много бактерий.
Культуры на торфяном носителе
Торф высушивают либо при обычной температуре, либо при осторожном
нагревании до влажности около 10% (на сухую массу), а затем измельчают
при помощи молотковой мельницы до порошка, который просеивают через сито
(200 меш) и доводят pH до 6,5-7,0, добавляя тонко измельченный СаСОз.
Такой торф можно использовать как стерильный или нестерильный носитель. О
пригодности партии торфа для получения инокуля-тов Rhizobium нельзя
судить по общим его свойствам, и на каждой из них проводят пробные
выращивания именно тех штаммов, которые предполагается использовать. Рост
и выживаемость бактерий в торфе зависят от многих факторов.
Нестерильные инокуляты на торфе
К подготовленному измельченному торфу добавляют до 40% (по массе) жидкой
культуры, тщательно перемешивают смесь и оставляют ее для созревания в
неглубоких лотках. Через несколько суток смесь опять перемешивают, а
затем фасуют, обычно в заплавленные мешочки из полиэтиленовой пленки
(толщиной 0,0375 мм). За первые несколько недель после приготовления
смеси число жизнеспособных клеток Rhizobium обычно увеличивается в 2-5
раз. Если держать фасовки при низкой температуре, бактерии обычно долгое
время сохраняют жизнеспособность. Возможное время хранения оценивают
исходя из продолжительности периода, за который погибает 90% клеток
(время уменьшения численности до 7ю от первоначальной). Это время
варьирует от 90 недель (при 5°С) до 8 (при 25 °С). При благоприятных
условиях культуры можно хранить до года (время уменьшения численности до
*/ю >16 недель), но срок этот заметно меньше, когда они содержатся при
комнатной температуре. Точно предсказать возможную продолжительность
хранения нельзя, и ее приходится определять для каждой партии отдельно.
Сельское хозяйство и биотехнология
361
Стерильные инокуляты на торфе
Заплавленные полиэтиленовые или полиамидные мешочки с подготовленным
измельченным влажным торфом стерилизуют в автоклавах (например, при 115°С
в течение 4 ч) или же путем у-облучения (примерно 4,5-106 рад). Затем при
помощи шприца для инъекций в них вводят нужный объем жидкой культуры
(порядка 10 мл). Прокол запаивают и мешочки ставят на инкубацию, в ходе
которой происходит существенное размножение бактерий.
Носители для Rhizobium
Твердый инокулят состоит из бактерий и носителя, роль которого
заключается в поддержании жизнеспособности клеток, поскольку он частично
защищает их от пересыхания. Кроме того, носитель способствует более
равномерному распределению бактерий в массе семян и помогает им
прикрепиться к их поверхности. Хотя в случае бактериальных суспензий
нередко получались хорошие результаты, считается, что применение торфа
как носителя более эффективно: при использовании жидких культур или же
суспензий' клетки Rhizobium после инокуляции и прикреплении их к
поверхности семян оказываются практически беззащитными. Поэтому при
производстве коммерческих ино-кулятов вначале чаще всего использовали
именно торф. Однако торф есть далеко не везде, а если он и имеется, то
сказать заранее, пригоден ли он как носитель, невозможно. В связи с этим
были предприняты поиски альтернативных носителей с такими же защитными
свойствами, как у торфа.
С неодинаковым успехом для этой цели были испробованы всевозможные
композиции: разнообразные смеси почвы и торфа, в которые были добавлены
молотая люцерна, измельченная солома, дрожжи или сахар; нильский ил с
добавками питательных веществ; почва, смешанная с кокосовыми охлопьями
