Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
С помощью бактерий были получены с высоким выходом некоторые белки -
продукты генов животных и их вирусов. Так, были созданы штаммы Е. coli, у
которых 20% всего клеточного белка составляли коровый антиген вируса
гепатита В, гормон роста человека или главный капсидный антиген вируса
ящура. У одного из сконструированных штаммов В. subtilis последний
составлял около 1 % синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться
экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их
вирусов совсем непросто, даже если эти гены сопряжены с сигналами
инициации транскрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме высокий
уровень экспрессии генов прокариот. Причины такой неэффективной
экспрессии не всегда ясны, но в некоторых случаях удалось установить, что
протеазы бактерий быстро разрушают белки животных и вирусов. В подобных
ситуациях можно повысить выход, применяя несодержащие протеаз мутанты.
При выработке проинсулина, предшественника инсулина, некоторая защита от
протеаз обеспечивается тем, что полипептид секрётируетсй в
периплазматичёско'е пространство у клеточной стенки Е. coli. На N-конце
молекулы препроинсулина находится последовательность гидрофобных
аминокислот, с помощью которой (с одновременным ее отщеплением)
осуществляется транспорт этой' молекулы через мембрану в- периплаз-
320
Глава 7
матическое пространство. Время полужизни проинсулина в "летке 2 мин, а в
периплазматическом пространстве 20 мин.
Другой способ получения чувствительных к протеазам белков основан на
выделении их бактериями Bacillus в окружающую среду. Эти бациллы в
отличие от Е. coli способны экскре--тировать некоторые белки. Так,
получены штаммы Bacillus, осуществляющие экскрецию проинсулина.
Выделенный в среду "белок обычно проще очищать, чем внутриклеточный.
Помимо этого, использование штаммов Bacillus имеет то преимущество, что
они не образуют эндотоксинов. Выяснилось, однако, что клетки Bacillus
эффективно экскретируют, видимо, лишь некоторые типы полипептидов. В
опытах с дрожжами проблема секреции была решена путем создания векторов,
содержащих сигнальные последовательности генов a-фактора гормона
спаривания или токсина-"убийцы".
7.4.3. Прикладные аспекты генетической инженерии
Не вызывает сомнения, что методы генетической инженерии будут играть
ведущую роль в развитии биотехнологии и найдут в ней самое широкое
применение. Уже сегодня с помощью бактерий и дрожжей мы получаем в
больших количествах белки эукариот и вирусов, которые применяются в
медицине и ветеринарии. В табл. 7.1 перечислены некоторые белки, для
синте-
Таблица 7.1. Белки эукариот и вирусов, получаемые методом клонирования
генов в микроорганизмах
Инсулин человека
а-, Р- и 7-интерфероны
Коровый антиген вируса гепатита В
Поверхностный антиген вируса гепатита В
Гормон роста человека
Капсидный белок вируса ящура
Реннин теленка
за которых используется этот подход. Образование больших количеств
ненужного бактериальной клетке белка ставит ее в неблагоприятное
положение при отборе, так что приходится решать сложные проблемы
стабилизации таких штаммов. Их удается решить - по крайней мере в случае
выработки очень ценных продуктов - путем создания жестких условий отбора,
направленных на сохранение плазмидного вектора, а иногда и клонируемого в
нем гена. Использование индуцибельных промоторов типа XPl препятствует
постоянному синтезу продукта, и он образуется лишь в результате индукции
в определенное .время клеточного цикла.
Генетика и биотехнология
321
Проблема стабилизации не возникает, если вместе с клонируемым геном
клетка-хозяин получает определенные преимущества при отборе. Так, методы
генетической инженерии позволяют расширить спектр используемых
микроорганизмом субстратов. Пивоварение, например, заинтересовано в
создании штаммов дрожжей, способных к секреции ферментов, разрушающих
крахмал и белки. Появление у организма ряда новых ферментативных
активностей может увеличить эффективность его обмена веществ. Так, фирме
ICI удалось повысить эффективность усвоения азота клетками Methylophitus
methylotrop-hus, продуцента БОО, введя в них ген фермента глутаматде-
гидрогеназы Е. coli (рис. 7.7). Это позволило увеличить выход БОО
примерно на 7% при росте бактерий на метаноле и аммиаке. Сегодня мы можем
уже конструировать искусственные линейные хромосомы дрожжей Saccharomyces
cerevisiae, что в принципе позволяет осуществлять стабильную модификацию
клеток путем формирования в них новых путей метаболизма.
Введение чужеродного гена в клетки организма-проду-цента - это отнюдь не
единственный генно-инженерный способ конструирования новых штаммов.
Иногда оказывается полезным клонирование собственных генов организма.
Так, если известно, что определенная ферментативная реакция лимитирует
скорость какого-то метаболитического процесса, то введение многих копий
соответствующего гена в рекомбинантные плазмиды может ликвидировать это
"узкое место" благодаря образованию большего числа молекул фермента.
