Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Бич Г. -> "Биотехнология. принципы и применение " -> 137

Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.

Бич Г., Бест Д., Брайерли К., Кумбс Дж. Биотехнология. принципы и применение — М: Мир, 1988. — 480 c.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка): biotehnologiyaprincipiiprimeneniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 131 132 133 134 135 136 < 137 > 138 139 140 141 142 143 .. 210 >> Следующая

ампициллину. На карте указаны места расщепления этой молекулы
эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами).
Используемые при клонировании рестриктазы выделяют из. различных
прокариот. Всего было получено более ста пятидесяти их разновидностей.
Они отличаются друг от друга тем, что* узнают и расщепляют разные
нуклеотидные последовательности. Сайты узнавания для большинства
ферментов, используемых в генетической инженерии, представляют собой
палиндромы из 4, 5 или 6 нуклеотидов. Расщепление происходит с
образованием либо "тупых" (как в случае Л/"1), либо липких (способных к
комплементарному связыванию) концов (как в случае BamHl; см. рис. 7.6).
Неспаренные нуклеотиды липкого конца) оканчиваются З'-гидроксильной или
б'-монофосфатной группировкой в зависимости от фермента.
Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и
встраиваемой ДНК одной и той же рестрик-тазой. При этом получаются
молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую
рекомбинантную' молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. В случае плазмиды
pBR322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к
антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по
их неспособности обеспечить устойг чивость.
ТлЬва 7
ДНК-лигазу фага Т4 можно применять и для сшивания "тупых" концов молекул
ДНК, хотя этот процесс осуществляется ¦труднее, чем в случае липких
концов. Липкие концы можно .превратить в тупые путем отщепления
одноцепочечных выступающих участков специфичными только к- таким участкам
-нук-.леазами. Альтернативный способ основан на использовании ДНК-
полимеразЫ: она присоединяет к короткой Цепи недостающие нуклеотиды,
комплементарные 5'-оДйоцепоНечной выступающей части молекулы. Лигаза'
применяется также для встраивания в плазмиды синтезированных фрагментов
ДНК с целью получения на стыке ДНК-вставки и вектора нужной
последовательности. Комплементарные однойепочечные концы у вектора и
встраиваемой ДНК могут быть образованы при помощи концевой ДНК-
шуклеотидиЛтрансферазы: она присоединяет нуклеотиды к З'Жонцам молекуй
ДНК. 'С 'её помощью к З'-концам вектора ;могут быть добавлены "хвосты" из
нескольких остатков дезоксигуаниловой кислоты [oligo(dG)], а к кон-щам
встраиваемой молекулы - комплементарная последовательность oligo(dC).
Смысл этой процедуры состоит в том, что повторное лигирование вектора
становится невозможным.
Трансформация
Полученные in vitro рекомбинантные щлазмиды необходимо перенести в
подходящую клетку-хозяина, природа которой и определяет особенности
способа трансформации. Так, клетки Е. coli становятся компетентными ,(т.
е. способными захватывать очищенную' ДНК) после обработки их на холоду
СаСЬ, а цлетки Bacillus sublilis приобретают компетентность на
определенной фазе клеточного цикла при их разовом культивировании в
условиях дефицита питательных веществ. Многие другие бактерии, включая
виды Streptomyces, можно трансформировать только в форме протопластов,
когда удалены клеточные стенки. Для облегчения проникновения ДНК в
дрожжевые клетки после обработки их СаС12 или ПЭГ из этих клеток также
часто получают протопласту. .Интактные, дрожжевые клетки становятся
компетентными после обработки ионами щелочных металлов, например U+..
.....
7.4.2. Экспрессия клонированных генов
.Цель многих опытов по клонированию состоит в наработке в большом
количестве какого-либо белка эукариот. Именно для этого:и встраивают геры
эукариот, з цлазмиды бактерий. Чтобы достичь высокого уровня экспрессии
гена, эукариотическую ДНК нужно встроить вблизи от активного промотора
транск-
Генетика я биотехнология
рипции; образующаяся мРНК при этом должна эффективно транслироваться.
Промоторы, использующиеся для обеспечения активной экспрессии, обычно не
принадлежат к числу изначально присутствующих в плазмидах. Как правило,
это бывают промоторы фаговых или хромосомных генов, включаемые &
ялазмидные векторы. Типичным примером такого рода служит промотор PL
бактериофага А.. ДНК с таким промотором эффективно транскрибируется, и
образуется большое количества мРНК. Контроль за работой Pl осуществляется
белком-репрес-сором, продуктом гена Ci этого бактериофага. Ген Cis57
кодирует температурочувствительный белок-репрессор, который активен при
30°С, но не работает при 42°С. Если внести этот ген в составе плазмиды
или фага в ту же клетку, что и промотор Pl, то экспрессию клонированных
генов, контролируемую PL, можно регулировать, изменяя температуру.
У дрожжей Saccharomyces cerevisiae векторы с высоким-уровнем экспрессии
конструируют на основе промоторов генов, которые кодируют важнейшие
клеточные белки (например, ал-когольдегидрогеназу и фосфоглицераткиназу).
Так, с помощью промотора алкогбльдегидрогеназы С1 удалось добиться прямой
транскрипции в дрожжах гена инсулина человека, а в опытах с
использованием промотора фосфоглицераткиназы получен-высокий уровень
экспрессии генов интерферонов.
Предыдущая << 1 .. 131 132 133 134 135 136 < 137 > 138 139 140 141 142 143 .. 210 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed