Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
температурочувствительных мутаций, но чаще всего для этого используются
маркеры устойчивости к химическим веществам. Последний метод был
предложен Литтлфилдом, который провел опыты по слиянию устойчивой к
бромдезоксиуридину лини" (BUdRr) L-клеток мыши и еще одной линии,
устойчивой к аза-гуанину (AGr). В клетках BUdRr отсутствует фермент
тимидин-киназа (ТК), а в клетках AGr - инозинпирофосфорилаза (IPP). Ни
клетки ТК_1РР+, ни клетки TK+IPP- не растут на среде, содержащей
гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Ами-ноптерин ингибирует биосинтез
нуклеотидов; трифосфаты пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов могут
синтезироваться только клетками, способными использовать и тимидин, и
гипоксантин. Для жизнедеятельности этим клеткам необходимы активные
ферменты ТК и IPP. Таким образом, среди продуктов слияния TK+IPP-,
ТК~1РР+ и TK+IPP+ способностью к росту, будут обладать лишь клетки, у
которых активны оба фермента,.
Генетика и биотехнология
313
Использование таких приемов отбора позволило получить гибриды не только
путем слияния линий клеток одного вида, но и межродовые гибриды клеток
человека с клетками мыши я крысы. Эти линии клеток грызунов/человека
нестабильны, 'причем легче они теряют хромосомы человека, так что после
тридцати делений в процессе выращивания у них остается все-то семь из 24
хромосом человека, изначально присутствовавших :в гибридной клетке. Этот
процесс элиминации хромосом был применен при картировании генома
человека, поскольку таким путем удается быстро локализовать определенные
гены на .хромосомах.
Моноклональные антитела
Один из результатов использования метода слияния клеток млекопитающих
чрезвычайно быстро нашел применение в биотехнологии: это линии клеток,
полученных при гибридизации с участием клеток миеломы (так называемые
"гибридомы"), с помощью которых могут вырабатываться моноклональные
антитела. Этот метод, разработанный в Кембридже Мильштейном я его сотр.,
основан на создании "бессмертных" клеток, производящих антитела, за счет
слияния их с клетками миеломы.
Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора
антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит цродуцирует лишь одно из них.
Миеломы - это злокачествен-яые новообразования иммунной системы; они
развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии
лимфоцитов. При этом в больших количествах синтезируется один тип белков-
антител. Иными словами, миеломы являются природными продуцентами
моноклональных антител. По методу Миль-штейна проводят слияние нормальных
(неопухолевых) лимфоцитов и клеток миеломы. Вначале полученные гибриды
синтезируют смесь антител, включающую два типа антител родительских
клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых
и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследствии в результате
элиминации хромосом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь
одного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в геноме
лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток миеломы. (Скрининг и
обнаружение клона, синтезирующего искомое антитело, ведут при помощи
биохимических и иммунохими-неских методов. Схема этого метода дана на
рис. 7.5.
Область возможного применения моноклональных антител весьма обширна. Их
используют в диагностике, например для быстрого и точного типирования
тканей и органов, предназначенных для пересадки. Они находят применение
при очистке (белков и других биологических соединений методом иммуноад-
314
Глава 7
Введение антигена в организм мыши
Культура клеток миеломы
Клетки п О
7°°с
О О
селезенки о°0п°
Слияние в лолиэтиленгликоле
°#ч#
Г)** °
"°е
ООО
# Клетки • • миеломы.
•••
Посев на среду HAT
Растут только гибридные кяетки'
Скрининг для отбора клонов, образующих специфические антитела против
введенного антигена
Размножение нужных клонов
Крупномасштабное производство моноклональных-антител с помощью;
1) выращивания большого количества клеток или
2) индукции опухолей,мышей путем инъекции
Рис. 7.5. Метод Милыитейна;
Генети&а'и биотехнология
315
сорбции. Секер и Берке использовали моноклональные антитела для очистки
больших количеств интерферона из лимфоцитов человека (гл. 8). Очевидно,
что такой подход пригоден и для очистки интерферона, синтезируемого
бактериями-рекомбинантами. Возможности применения моноклональных антител
для пассивной Иммунизации ограничены, во всяком случае, у больных людей,
поскольку пока не удалось получить стабильные клоны на основе клеток
человека.
7.4. Опыты по генетической инженерии in vitro
7.4.7. Технология
Для получения разнообразных белков эукариот и вирусов животных широко
применяются бактерии и дрожжи Saccharomyces cerevisiae. При этом
используются самые разные методы, но наиболее широко, те из дих, которые
описаны ниже.
. Прежде всего необходимо изолировать нужный ген. Если ген животного
должен экспрессироваться в клетках бактерий или дрожжей, то обычно
