Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
RP4. Обычный механизм рекомбинации в клетках бактерий, •основанный на
взаимодействии гомологичных молекул ДНК и зависимый от продукта
бактериального гена rec А+, в переносе этого гена устойчивости к
антибиотику не используется. В последующие годы было описано множество
других транспозонов. Большинство из них было обнаружено в R-плазмидах
грамотрицательных бактерий; обычно они придают им устойчивость к
антибиотикам. Лучше всего изучен транспозон ТпЗ длиною 4957 пар
нуклеотидов, обеспечивающий устойчивость к пенициллину.
Последовательности из 38 пар нуклеотидов на концах ТпЗ одинаковы, но
противоположно направлены. В транспозо-не закодирована информация о
ферменте транспозазе, играющем важную роль в его перемещениях
(транспозициях). Этот транс-яозон может встраиваться во множество
сегментов молекулы ДНК, но предпочитает АТ-богатые участки.
Транспозоны могут служить маркером гена, предназначенного для
клонирования. Как известно, при клонировании хромосомных генов бактерий
иногда возникают сложности, связанные с тем, что нет простого метода,
позволяющего выявить, какая из плазмид, несущих встроенный фрагмент
хромосомной ДНК, содержит интересующий исследователя ген. Иногда эту
проблему удается решить, выделив сначала мутант по этому :гену с
включенным в него или расположенным поблизости дранспозоном.
7.3.2. Слияние протопластов
С целью преодоления преград для генетического обмена, существующих в
обычных системах скрещивания, был разработан метод слияния протопластов
(клеток с удаленными клеточными оболочками). Этот метод пригоден для
получения межвидовых и даже межродовых гибридов. Его можно использовать
при гибридизации клеток одного вида, которые принадлежат к несовместимым
группам спаривания или же когда природная система скрещивания
малоэффективна в плане образования генетических рекомбинантов.
Слияние протопластов бактерий
Метод слияния протопластов был впервые использован в опытах с бактериями
для получения межвидовых гибридов Bacillus ¦megaterium'KBacillus
subtilis. В природе эти бактерии не
Генетика и биотехнология
309
конъюгируют, но легко трансформируются изолированной ДНК- Путем слияния
протопластов, индуцируемого либо поли-этиленгликолем, либо СаСЬ, получить
их гибриды несложно. При этом частота рекомбинации может достигать 10~5-
10-4; процесс нечувствителен к ДНКазе, следовательно, он осуществляется
без трансформации.
Этот метод нашел широкое применение при гибридизации видов Streptomyces.
Так, Streptomyces coelicolor обладает плазмидозависимой системой
фертильности или скрещивания (с. 300), однако эта система малоэффективна,
а многие используемые в промышленности виды Streptomyces вообще не
способны к обычному скрещиванию. Если же применить метод •слияния
протопластов, индуцируемого полиэтиленгликолем, то частоту рекомбинации
удается повысить примерно на четыре порядка по сравнению с наблюдаемой
при обычном скрещивании. Максимальная частота рекомбинации, достижимая
при работе этим методом, составляет 10-20%. Штаммы не обязательно должны
нести селективные генетические маркеры, поскольку при использовании этого
метода возможен прямой отбор гибридов с нужным свойством. Это дает
большие преимущества при конструировании промышленно важных штаммов,
поскольку работа по введению подходящих маркеров нередко превращается в
утомительное трудоемкое занятие.
Слияние протопластов грибов
Образование гибридов грибов с помощью слияния протопластов изучалось
очень активно; этот метод нашел применение в промышленности при создании
штаммов Cephalosporium acremo-nium, для которых характерны высокая
скорость роста и большой выход цефалоспорина. Первые опыты по слиянию
были выполнены с ауксотрофными мутантами Geotrichum cand.id.um, у которых
не обнаружено ни половой, ни парасексуальной систем. Слияние протопластов
осуществляли путем центрифугирования, причем прототрофные гетерокарионы
образовывались с низкой частотой. Впоследствии слияние обычно
осуществляли, добавляя ионы Са2++ или ПЭГ.
Межвидовые слияния удалось провести как в опытах с различными
мицелиальными грибами, так и с дрожжами, среди которых были и такие
промышленно важные организмы, как Penicillium chrysogenum, Aspergillus
niger, Candida tropicalis, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis и
Saccharomyces cerevisiae. Слияние обычно происходит с частотой 0,2-2%.
Вероятность слияния ядер, приводящего после слияния клеток к образованию
диплоидов, зависит от вида организма. Здесь вскрыта определенная
закономерность: мицелиальные грибы
310
Глава 7
дают гетерокар ионы, диморфные дрожжи - нестабильные диплоиды, а истинные
дрожжи - стабильные диплоиды (рис.
7.4).
Межвидовые слияния также происходят с достаточно высокой частотой,
особенно у относительно близкородственных видов Aspergillus или
Penicitlium. Если сливаются ядра, то за этим обычно следует потеря
хромосом. Нередко после выра-
Г етерокарионы
Geotrichum candidum Phycomyces biakesieeanus Mucor racemosus
