Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Айала Ф. -> "Современная генетика. Том 2" -> 69

Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.

Айала Ф. , Кайгер Дж. Современная генетика. Том 2 — М.: Мир, 1988. — 368 c.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка): sovremennayagenetikat21988.djvu
Предыдущая << 1 .. 63 64 65 66 67 68 < 69 > 70 71 72 73 74 75 .. 164 >> Следующая

электронной микроскопии можно предположить, что мономерные молекулы
интегразы при взаимодействии с ДНК олигомеризуются, что способствует
образованию контактов между участками POP' и ВОВ'. Разрезание и
воссоединение цепей, приводящее к рекомбинации, может протекать с
образованием промежуточной формы, подобной структуре Холлидея с очень
коротким гетеродуплексным участком. При int-зависимой рекомбинации в
редких случаях удается наблюдать образование гетеродуплексных участков,
заметно выходящих за пределы области POP'. Таким образом, возникновение
промежуточной крестообразной структуры характерно как для сайт-
специфической, так и для общей рекомбинации.
Как уже упоминалось, для осуществления сайт-специфической рекомбинации
фага X необходимо присутствие некоторых хозяйских белков. Штаммы Е. coli,
мутантные по одному из генов himA, himB или hip, неспособны обеспечивать
интеграцию профага X. Мутации в этих генах носят плейотропный характер и
блокируют также интеграцию других типов профагов на других
соответствующих участках ДНК. Более того, эти мутации препятствуют
развитию в клетках транспозоноподобного фага Ми, а также точному
вырезанию транспозонов, определяющих устойчивость к антибиотикам (см.
следующий раздел). Плейотропность этих мутаций, сказывающихся как на
сайт-специфической, так и на незаконной рекомбинации, свидетельствует о
том, что соответствующие клеточные белки играют скорее некоторую
неспецифическую роль, например способствуют реализации взаимодействий
ДНК-ДНК или ДНК-белок.
Дополнение 14.2. Футпринтинг - метод изучения ДНК-белковых
взаимодействий____________________
B uiимодействие белков с определенными нуклеотидными последовательностями
ДНК играет важнейшую роль в функционировании генетического материала. Для
изучения взаимодействий между белками и участками нуклеотидной
последовательности удается использовать те же экспериментальные подходы,
что и для определения нуклеотидной последовательности.
В гл. 9 мы рассмотрели, как при электрофоретическом анализе одной из
цепей рестрикционного фрагмента ДНК, содержащей радиоактивную метку на
одном конце и случайно расщепленной тем
или иным способом, удается выявить полный набор фрагментов, отличающихся
последовательным изменением длины с шагом в один нуклеотид. В примере,
приведенном на рис. 9.8, случайное расщепление в каждом случае происходит
по одному из четырех нуклеотидов. Все возможные фрагменты таким образом
распределяются по четырем дорожкам, в каждой из которых разделяются
фрагменты, заканчивающиеся на А, Т, G или С. При этом нуклеотидную
последовательность искомого фрагмента ДНК можно считывать непосредственно
по радиоавтографу, полученному с геля после электрофореза.
14. Рекомбинация
157
Рис. 14.15. Локализация сайтов связывания интегразы фага X с участком
POP' с помощью метода "фут-принтинга". Аликвоты, содержащие
рестрикционный фрагмент, 5'-конец одной из цепей которого помечен 32Р,
подвергали частичному расщеплению неокарциностатином (расщепляет по А и
Т) в присутствии и в отсутствие интегразы или гепарина. Набор
образующихся фраг-МЬнтов анализировали с помощью гель-электрофореза (три
левые дорожки). В двух правых дорожках - фрагменты, образующиеся при
расщеплении того же меченого фрагмента по пуриновым или по пиримидиновым
нуклеотидам методом Максама - Гилберта, для идентификации участков
последовательности, защищаемых интегра-зой. (По Hsu P. L,
Ross W., Landy А., 1980. Nature, 285, 85 91.) Reprinted by permission.
Copyright (c) 1980-Macmillan Journals Limited.
Интеграза ~+ + ~
Гепарин
A+G
Р'-плечо
Кор-последо-
вательность
Функциональная
область
attP
Р -плечо 2
Р -плечо 1
+100
-150
В том случае, когда нуклеотидная последовательность уже известна, можно
установить, какие участки последовательности связываются с определенным
белком. Для этого достаточно определить участки, защищаемые этим белком
от расщепления. Защищенные участки идентифицируются на основании данных
электрофореза, по исчезновению полос, соответствующих продуктам
статистического расщепления, концевые нуклеотиды которых попадают в
область связывания с белком. Именно этот подход был использован для
локализации сайтов связы-
вания интегразы с участком POP' ДНК фага X.
Рестрикционный фрагмент, содержащий участок POP' и меченый 32Р по одному
из 5'-концов, случайно расщепляли ДНКазой I (или любым другим способом,
приводящим к образованию одноцепочечных разрывов) в присутствии и в
отсутствие интегразы. После этого оба образца нагревали для расхождения
цепей, только одна из которых содержала метку, и анализировали с помощью
электрофореза. Результаты такого эксперимента представлены на рис. 14.15.
При электрофорезе
158
Экспрессия генетического материала
образца, расщепленного в отсутствие ин-тегразы, наблюдается полный набор
фрагментов расщепления. В случае образца, полученного в присутствии
интегразы, выявляются характерные пропуски (или "следы" -footprints),
Предыдущая << 1 .. 63 64 65 66 67 68 < 69 > 70 71 72 73 74 75 .. 164 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed