Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
ковалентной связи с З'-ОН-группой концевого нуклеотида растущей цепи
необходимо наличие правильной системы водородных связей, обеспечиваемой
комплементарными взаимодействиями между основаниями. В случае ошибочного
включения неправильного нуклеотида дальнейшая полимеризация блокируется и
активируется присущая ферменту 3' -*¦ -> 5'-экзонуклеазная активность.
Происходит вырезание ошибочно включенного нуклеотида, фермент
перемещается назад так, что в центр концевого участка затравки попадает
предыдущий нуклеотид, после чего полимеризация продолжается обычным
путем. Таким образом, правильность каждого включающегося в растущую цепь
нуклеотида проверяется дважды. У -> 5'-экзонуклеазная активность ДНК-
полимеразы при этом осуществляет корректорскую функцию {proofreading).
Если каждый этап проверки снижает частоту возникновения ошибок на два
порядка (10 ~2), то при реализации двух независимых этапов проверки
частота возникновения ошибок уже будет оцениваться величиной 10 "4.
Исследование точности репликации ДНК фага фХ174 in vitro ДНК-по-лимеразой
I, с использованием в качестве теста - определения инфекционной
способности образующихся молекул ДНК, выявило возникно-
Экспрессия генетического материала
вение ошибок с частотой около 10 _6, очень близкой к величине,
предсказанной на основании подобных расчетов (10 ~ 2 • 10 " 2 • 10 ~ 2).
Добавление к реакционной смеси очищенного SSB-белка понижало частоту
возникновения ошибок еще в 10 раз.
ДНК-полимераза III Е. coli также обладает 3' -> 5'-экзонуклеазной
активностью, придающей ферменту дополнительную корректорскую функцию. При
использовании этого фермента для репликации ДНК фага фХ174 в системе in
vitro, подобно тому как это показано на рис. 13.11, частота возникновения
ошибок оценивается величиной 5-10" 1. Существенно отметить, что даже
такая низкая величина намного превышает реальное значение частоты
возникновения ошибок при синтезе ДНК Е. coli in vivo (10 ~ 8-10 "10).
Наблюдаемая повышенная точность процессов, протекающих in vivo,
обусловлена существованием дополнительных репарационных функций, которые
обсуждаются в следующем разделе.
Эукариотические ДНК-полимеразы не обладают 3' -> -> 5'-экзонуклеазной
активностью и обусловливают гораздо более высокую частоту возникновения
ошибок при репликации ДНК фага фХ174 in vitro. При одинаковых условиях
для эукариотических полимераз наблюдались следующие частоты: 3-10" 5 для
ДНК-полимеразы a (Pol а), 1,2-3,0-10 - 4 для ДНК-полимераз Р и у-
Очевидно, что для обеспечения необходимой точности репликации в
эукариотических клетках должны присутствовать дополнительные ферменты,
повышающие точность этого процесса. Некоторые биохимические данные
свидетельствуют о наличии у эукариот фермента с 3'-* 5'-экзонуклеазной
активностью, действующего в контакте с ДНК-полимеразой а. Этот фермент
может обеспечивать корректорскую функцию in vivo, утрачиваемую в ходе
очистки ДНК-полимеразы а.
Можно думать, что эволюция системы коррекции и других вариантов
исправления ошибок репликации сделала возможным использование РНК в
качестве затравки для обеспечения механизма синтеза отстающей цепи ДНК.
Способность РНК-полимеразы синтезировать цепь de novo без какой бы то ни
было затравки, вероятно, сопряжена с более высокой частотой возникновения
ошибок, чем в случае ДНК-полимераз, способных функционировать только при
наличии затравки. Удаление потенциально ошибочной РНК-затравки 5' -> З'-
экзонуклеазами и ее замещение на ДНК, являющуюся объектом тщательного
контроля и коррекции, устраняют проблему возникновения ошибок, связанную
с инициацией синтеза de novo.
Исправление ошибок репликации и репарация ДНК
Несмотря на корректорские функции, присущие ДНК-полимеразам Е. coli,
некоторые нуклеотиды оказываются все же ошибочно включенными в
новообразованную цепь ДНК. Их присутствие делает возможным возникновение
спонтанных мутаций, в том случае если ошибки не будут исправлены до
начала следующего цикла репликации. Свидетельства в пользу существования
пострепликационных систем исправления ошибок, или репарации, были
получены при изучении таких явлений, как
13. Генетический контроль синтеза ДНК
123
генная конверсия и высокая отрицательная интерференция, связанных с
рекомбинационными процессами (см. гл. 14). Дополнительные данные были
получены благодаря обнаружению мутаций, инактивирующих ферменты,
вовлеченные в систему исправления ошибок репликации. Эти мутации заметно
повышают частоту спонтанных мутаций во всех генах организма. Наиболее
полно система исправления ошибок репликации изучена у Е. coli.
Для нормального функционирования аппарата исправления ошибок, связанных с
включением неправильных нуклеотидов, необходимо располагать механизмом,
позволяющим отличать новосинтезированную цепь ДНК от родительской
матричной цепи. В противном случае с вероятностью 1/2 будет происходить
"исправление" нуклеотида в родительской цепи, приводящее к закреплению
