Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
определения нуклеотидной последовательности. Описанный метод схематически
изображен на рис. 13.9.
ДНК-полимеразу I, используемую для
определения последовательности ДНК методом терминации цепи, определенным
образом обрабатывают для того, чтобы избавиться от свойственной этому
ферменту 5' -*¦ 3' экзонуклеазной активности. Активность этого типа может
мешать осуществлению манипуляций, приведенных на рис. 13.9, атакуя 5'-
конец праймера, используемого для инициации полимеризации. При обработке
ДНК-полимеразы I протеиназой субтилизином, происходит расщепление
фермента на два крупных полипептида, один из которых проявляет 5' -*¦ 3'
экзонуклеазную активность, а другой содержит каталитический центр
полимеризации. Последний фрагмент (известный как фрагмент Клёнова)
сохраняет полимеразную активность и может быть полностью очищен от
примеси 5' -> -> З'-экзонуклеазного фрагмента.
На первый взгляд казалось, что это наблюдение свидетельствует о
функциональной заменимости ДНК-полимеразы I. Однако дальнейшие
исследования показали, что мутация polA не затрагивает 5' -> -*¦ З'-
экзонуклеазной активности Pol I. Удалось получить добавочные
температурочувствительные мутации гена polA, подавляющие 5' -> -*¦ З'-
экзонуклеазную активность и летальные при рестриктивной температуре. На
основании этих данных был сделан вывод о том, что 5' -*¦ -*¦ З'-
экзонуклеазная активность Pol I является жизненно важной функцией,
необходимой для удаления РНК-затравок при репликации, т. е. для
обеспечения нормального синтеза полноценной отстающей цепи ДНК (рис.
13.3). В действительности для исходного ро/А-мутанта было показано, что
фрагменты Оказаки встраиваются в протяженные участки цепи ДНК с некоторым
запаздыванием, и это свидетельствовало о возможном участии ДНК-полимеразы
I в заполнении пустот, возникающих после удаления РНК-затравок из
отстающей цепи. В то же время эту функцию Poll нельзя назвать жизненно
важной, поскольку в polA-мутантном штамме с ней вполне успешно
справляется фермент Pol III.
Изучение штаммов, мутантных по гену pol II (например, мутация pol В
полностью выводит из строя этот фермент), показало, что активность этой
ДНК-полимеразы не является жизненно важной; ее непосредственная
функциональная роль в клетке не установлена. С другой стороны,
генетический анализ продемонстрировал, что присутствие Pol III необходимо
для синтеза ДНК в репликативной вилке. ДНК-полимераза III-это
полисубъединичный фермент, субъединицы которого кодируются жизненно
важными генами dnaE, dnaX и dnaZ, а также некоторыми другими, еще не
идентифицированными генами. Этот фермент необходим для синтеза как
ведущей, так и отстающей цепей ДНК. При синтезе отстающей цепи Pol III
использует РНК-затравки, синтезируемые праймазой, которую кодирует
жизненно важный ген dna G.
13. Генетический контроль синтеза ДНК 117
Биохимический анализ механизма репликации ДНК основан на выделении и
очистке ферментов и других белков, осуществляющих одну или несколько
стадий репликационного процесса in vitro. Разработке и изучению системы
репликации in vitro в значительной мере способствовало использование в
качестве матриц небольших подробно охарактеризованных вирусных геномов,
например фага фХ174, поскольку продукты их репликации in vitro также
легко поддаются изучению. Образование способных к инфекции молекул
вирусной ДНК in vitro может лежать в основе однозначного биологического
теста на аутентичность продукта репликации. Системы репликации in vitro
были разработаны для одноцепочечных кольцевых ДНК фагов фХ174, G4 и М13.
Благодаря этим исследованиям удалось сделать весьма примечательное
наблюдение, что эти фаги, каждый из которых может инфицировать Е. coli,
используют для своей репликации различные наборы генетических функций Е.
coli, связанных с синтезом хозяйской ДНК. На ДНК М13, окруженной SSB-
белками, инициация синтеза комплементарной цепи ДНК зависит от синтеза
РНК-затравки в определенном участке кольца, направляемого РНК-полимеразой
хозяина, которая в норме отвечает за транскрипцию хозяйской ДНК. РНК-
полимеразу ингибирует антибиотик рифампицин, который подавляет также
репликацию ДНК фага М13 in vitro и in vivo. С другой стороны, ДНК фага
G4, также связанная с SSB-белком, для синтеза инициирующей РНК-затравки
использует другой фермент клетки-хозяина - праймазу (продукт гена dna G).
В то же время для синтеза РНК-затравки и инициации репликации ДНК фага
фХ174, связанной с SSB-белком, требуется участие целого ряда хозяйских
белков, включая и продукты генов dna В и dna С. Во всех трех случаях
синтез ДНК на образовавшейся РНК-затравке инициируется ДНК-полимеразой
III. По-видимому, в репликации фХ174 участвуют все ферменты хозяина,
связанные с синтезом отстающей цепи ДНК в репликативной вилке, а в случае
фагов G4 и М13 необходимым является участие тех ферментов, которые
используются только для инициации репликации хромосомы.
Совокупность процессов, связанных с синтезом ДНК в репликативной вилке,
