Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
Molec. Gen. Genetics, 113, 273.) Б. На приведенной диаграмме
проиллюстрированы различия между процессами инициации и элонгации при
репликации хромосомы Е. coli. Мутация dnaE затрагивает элонгацию, а
мутация dnaA-инициацию репликации.
13. Генетический контроль синтеза ДНК
111
Рис. 13.6. Положение генов, вовлеченных в синтез ДНК, на хромосоме Е.
coli.
dnaE
.dmX / dnaZ
Ж
I wrA
iO
Л
--"'i
dnal
Локус Функция
polB ДНК-полимераза II
dnaE Субъединица ДНК-полимеразы III
dnaX Субъединица ДНК-полимеразы III
dnaZ Субъединица ДНК-полимеразы III
dnal Инициация репликации ДНК
дуг A Субъединица ДНК-гиразы(топоизомеразы II)
Hg ДНК-лигаза
dna G Праймазная субъединица праймосомы
дуг В Субъединица ДНК-гиразы(топоизомеразы II)
dna A Инициация репликации ДНК
ori С Участок инициации репликации ДНК
dnaP Инициация репликации ДНК
polA ДНК-полимераза I
rpoB Субъединица РНК-полимеразы
dna В Субъединица праймосомы
ssb SSB-белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК
dna С Субъединица праймосомы
ственной генетической функции. Некоторые мутации такого рода
сопровождаются изменениями, затрагивающими уже идентифицированные
ферменты. Другие позволяют идентифицировать новые ферменты. Если данная
мутация является летальной или условно-летальной, то затрагиваемая ею
функция, вероятно, играет важную роль в изучаемом процессе.
Экспрессия генетического материала
Первые указания на то, что в системе репликации ДНК участвует целый ряд
важных генетических функций, были получены благодаря выделению широкого
набора условно-летальных температурочувствительных мутантов Е. coli (dna
~), комплементационный анализ которых позволил соотнести их с мутациями в
ряде различных генов. Среди них можно выделить два класса мутантов,
которые при рестриктивной температуре: (1) немедленно прекращают синтез
ДНК или (2) в течение относительно протяженного временного интервала
постепенно прекращают синтезировать ДНК (рис. 13.5). Первый фенотип
связан с нарушением процесса синтеза ДНК в репликативной вилке, а второй-
с исчезновением способности инициировать новый цикл репликации хромосомы.
(В несинхронизированной культуре индивидуальные клетки мутантов второго
класса, находящиеся на различных стадиях репликации, начавшейся еще при
пермиссивной температуре, не прекращают синтезировать ДНК после повышения
температуры до полного завершения цикла репликации хромосомы.) После
сопоставления выделенных мутаций с определенными белками, на которых
сказываются эти мутации, можно начать изучение функциональной роли этих
белков in vivo. Локализация генов, ответственных за репликацию ДНК, на
хромосоме Е. coli показана на рис. 13.6.
Биохимический анализ репликации ДНК
В клетках Е. coli содержатся три различных фермента с ДНК-полиме-разной
активностью. Среди них наиболее полно изучена представленная в клетке
наибольшим числом молекул ДНК-полимераза I (Pol I). Этот фермент способен
направлять синтез комплементарной цепи по матричной цепи ДНК при наличии
соответствующей комплементарной затравочной цепи со свободной З'-ОН-
группой, связанной водородными связями с матричной цепью. Полимеризация
происходит в направлении 5' -*¦ 3' за счет взаимодействия очередного
дезоксирибонуклеозидтри-фосфата с З'-ОН группой растущей (затравочной)
цепи. Фермент Pol I обладает также 5' -> З'-экзонуклеазной активностью,
т.е. способен последовательно отщеплять 5'-нуклеотиды от цепи ДНК,
связанной с матричной цепью. На рис. 13.7 изображена модель структуры
ДНК-поли-меразы I с указанием расположения соответствующих функциональных
центров. Особые ферментативные свойства ДНК-полимеразы I сделали этот
фермент эффективным и весьма распространенным инструментом для изучения
нуклеиновых кислот (см. Дополнение 13.1).
Фермент Pol I считали единственной ДНК-полимеразой Е. coli до тех пор,
пока не была обнаружена мутация (polA), подавляющая эту полимеразную
активность (не менее чем на 98%), однако не сказывающаяся существенно на
способности мутантного штамма к размножению. Благодаря обнаружению
мутантного штамма polA биохимикам удалось идентифицировать и выделить две
другие ДНК-полимеразы, Pol II и Pol III, которые в обычных штаммах Е.
coli вносят небольшой вклад в общую ДНК-полимеразную активность.
13. Генетический контроль синтеза ДНК
ИЗ
Рис. 13.7. Модель ДНК-полимеразы I, показывающая расположение
функциональных центров фермента по отношению к матричной и затравочной
цепям ДНК.
Матричная цепь
Матри1
центр
ДНК- полимераза I
5* -*¦ З'-экзонуклеазный центр
Трифосфатный центр
Центр концевого участка затравки
3*-" 5-зкзоиуклеазный
(корректирующий)
центр
Затравочный центр
Затравочная цепь
Дополнение 13.1. Применение ДНК-полимеразы I
ДНК-полимераза I (или Pol I) Е. coli находит широкое применение в работе
с рекомбинантными ДНК и при определении нуклеотидной последовательности
ДНК. Одно из важнейших применений этого фермента связано с введением
радиоактивной метки в ДНК in vitro с помощью так называемой ник-
