Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши.
Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-
гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят
радиоактивными изотопами (такими, как 32Р или 3Н) с помощью ник-
трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные
хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на
рис. 18.17, эти препараты ДНК
18. Генетика соматических клеток: картирование генома
309
Таблица 18.2. Ферментные маркеры, используемые для определения групп
сцепления генов человека при работах с культурами клеток
Хромосома Плечо Фермент (символ гена)
1 Р Енолаза 1 (ENOl)
Р Фосфоглюкомутаза-1 (PGM1)
q Пептидаза-С (PEPQ
q Фумаратгидратаза (FH)
2 р Малат дегидрогеназа-1 (MDH1)
q Изоцитратдегидрогеназа-1 (IDH1)
3 р Аминоацилаза-1 (ACY1)
4 ? Пептидаза (PEPS)
р? Фосфоглюкомутаза-2 (PGM2)
5 q Р-гексозаминидаза-В (НЕХВ)
6 р Глиоксалаза 1 (GLO)
q Супероксидцисмутаза-2 (SOD2)
q Малатдегидрогеназа-1 (МЕ1)
7 q (3-глюкуронидаза (GUSB)
8 р Глутатионредуктаза (GSR)
9 р Аконитаза-1 (АС01)
q Аденилаткиназа-1 (АК1)
10 q Г лутамат-оксалоацетат-трансаминаза-1 (GO Т1)
11 р Лактатдегидрогеназа-А (LDHA)
12 р Триозофосфатизомераза-1 (TR11)
q Пептидаза-В (РЕРВ)
13 q Эстераза-D (ESD)
14 q Нуклеотидфосфорилаза (NP)
15 q Маннозофосфатизомераза (МР1)
q Пируваткиназа-М2 (РКМ2)
16 q Аденозинфосфорибозилтрансфераза (APR Т)
17 q Галактокиназа (GALK)
18 q Пептидаза-А (РЕРА)
19 ? Глюкозофосфат-изомераза (GPI)
7 Пептидаза (PEPD)
20 q Аденозиндезаминаза (ADA)
21 q Супероксиддисмутаза (SOD1)
22 q Аконитаза-2 (АС02)
X q Глюкозо-фосфатдегидрогеназа (GGPD)
q Фосфоглицерокиназа (PGK)
По Shous Т. В. (1982). Adv. Human Genetics, 12, 341-452.
обрабатывают рестрицирующими эндонуклеазами, а полученные фрагменты ДНК
разделяют гель-электрофорезом, денатурируют и переносят на
нитроцеллюлозные мембранные фильтры. На фильтрах осуществляется
гибридизация с тем или иным меченым ДНК-зондом. Для большей эффективности
можно разделять амплифицированные фрагменты хромосомной ДНК. Для этого
используют их предварительное клонирование на фаговых векторах.
После гибридизации фильтры накладывают на рентгеновскую пленку, на
которой после проявления обнаруживаются полосы, соответ-
310
Экспрессия генетического материала
Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании
гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибриди-зации
по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при
цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами
данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные
фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в
агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре
проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По
Shows Т. В. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)
Клои гибридных клеток человек - мышь
'V
Клетки для кариотипирования
Хромосомный набор гибридных клеток
Корреляция между присутствием ферментного маркера,
определенной хромосомы ^ .
и определенной полосы при гибридизации позволяет соотнести исследуемый
ген с той или иной хромосомой человека
?
Гомогенат
Электрофорез в крахмальном геле для определения ферментных маркеров
1
ДНК
I
Расщепление
рестриктазами
I
Разделение фрагментов электрофорезом в агарозном геле
Перенос фрагментов на нитроцеллюлозный фильтр, гибридизация с зондом,
меченным 32 Р
Радиоавтография фильтра, проявление пленки для выявления гибридиэующихся
зон
18. Генетика соматических клеток: картирование генома
311
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13
Рис. 18.18. Анализ гибридных клеток по методу Саузерна. ДНК гибридных
клеток мышь-человек обрабатывали рестриктазой HindIII и ги-бридизовали с
зондом протяженностью 900 п. н., содержащим вирусный онкоген туе. На
первой дорожке электрофореграммы гибриди-зуется полоса, соответствующая
по-
зиции фрагмента ДНК человека, на второй - фрагмента ДНК мыши. На дорожках
3-13 фракционированы фрагменты ДНК из гибридных линий. Последовательности
человека, гомологичные туе, присутствуют в клонах 3, 5, 6, 9, 11 и 12.
(По Sakaguchi A. Y. et al. 1983. Somatic Cell Genetics, 9, 391-405.)
ствующие рестрикционным фрагментам, содержащим последовательности ДНК,
гомологичные данному зонду (рис. 18.18). Гены соотносят с определенными
хромосомами человека на основании корреляции между присутствием данной
хромосомы в гибридной клеточной линии и наличием гибридизующегося
фрагмента человеческой ДНК на радиоавтограмме. Данный метод более
чуствителен, чем гибридизация ДНК в растворе и, главное, более
специфичен.
Результаты эксперимента по картированию гена химотрипсиногена В (CTRB)
приведены в таблице 18.3. "Плюсы" и "минусы" во втором столбце таблицы
отражают результаты гибридизации по Саузерну. Следующие столбцы таблицы
