Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
глобиновом гене кролика. При расщеплении Eco RI образуется протяженный
фрагмент, содержащий большую часть р-глобинового гена, включая оба
интрона (показаны белым) и 5'-фланки-рующую последовательность. Этот
фрагмент после электрофореза и переноса по Саузерну регистрируется по
гибридизации с радиоактивным зондом (слева). Расщепление этого фрагмента
рестриктазой Mspl происходит независимо от степени метилирования
содержащихся в нем последовательностей CCGG (середина). Характер
расщепления этого же фрагмента рестриктазой Hpall позволяет выявить
уровень тканеспецифичного метили-
рования CCGG-последовательностей (справа). Данный фрагмент в составе ДНК
спермы полностью метилирован, о чем говорит его абсолютная
нечувствительность к действию Hpall. В то же время этот фрагмент,
содержащийся в ДНК, полученной из культуры кроличьих клеток,
неметилирован и в одинаковой степени подвержен расщеплению Mspl и Hpall.
При изучении ДНК из клеток мозга и печени обнаруживается профиль
расщепления, представляющий собой смесь тех, что изображены на рисунке
слева и в середине. Таким образом в этих клетках имеет место неполное
метилирование соответствующих последовательностей. (По Razin A., Riggs A.
D., 1980. Science, 210, 604.)
228
Экспрессия генетического материала
профилем электрофоретического разделения фрагментов рестрикции как Hpall,
так и Mspl. В то же время в случае метилирования одной или более
последовательностей CCGG обнаруживаются различия в наборах рестрикционных
фрагментов, полученных при обработке ДНК этими рестриктазами (рис.
16.14). Более того, если метилирование некоторого сайта в ДНК не является
полным (то есть часть молекул ДНК в популяции метилирована, а часть -
неметилирована по данному сайту), то электрофоретический анализ
препарата, полученного при обработк ДНК рестриктазой Hpall, выявляет
картину, которая представляет собой сочетание электрофоретических
профилей, показанных на рис. 16.4. Таким образом, при сравнении
результатов электрофореза препаратов, полученных при расщеплении ДНК
рестриктазами Hpall и Mspl, можно
выявить степень метилирования сайтов CCGG в данном препарате ДНК.
Распределение сайтов метилирования в определенных генах можно изучить с
помощью переноса и гибридизации по Саузерну электрофоретически
разделенных фрагментов рестрикции с использованием в качестве
радиоактивных зондов искомых клонированных генов (рис. 16.14).
Метилирование тех или иных остатков может быть также выявлено при анализе
нуклеотидной последовательности по методу Максама - Гилберта. Метальная
группа в ш5С блокирует специфическое расщепление по этому остатку,
поэтому отсутствие соответствующего фрагмента в наборе, образующемся при
статистическом расщеплении по С, указывает точную локализацию
модифицированного основания.
Определенные сайты метилирования в ДНК соматических клеток оказываются
метилированными также и в ДНК дочерних клеток. При полукож;ерватавной
репликации последовательности Cm5CGG, в которой метилированы обе цепи,
дочерние ДНК первоначально получают только по одной метилированной цепи.
В эукариотических клетках присутствует так называемая поддерживающая
метилаза, которая вскоре узнает возникшие при репликации
"полуметилированные" сайты и метилирует остаток С в соответствующем сайте
новосинтезированной цепи ДНК (рис. 16.15).
В то же время уровень метилирования ДНК в клетках данного типа подвержен
изменениям. Изменения в уровне экспрессии генов данной клетки часто
сопровождаются процессами метилирования и деметилирования (рис. 16.15)
определенных сайтов, расположенных в области ло-
CHj
I
-CG - -GC-
Поддерживающее
метилирование
Полуметилн -рованный сайт
Репликация
ДНК
СН3 I
CG -
GC-
I
сн3
Полностью
метилированный
сайт
Метилирование de novo
^
Деметилирование
-CG-
-GC-
-CG-
-GC-
Рис. 16.15. Три возможных состояния метилирования CG-сайтов в
двухспиральной ДНК. Полуконсервативная репликация полностью
метилированного сайта приводит к образованию полуметилированного сайта,
т.е. метилированного только по остатку С родительской цепи.
Поддерживающая метилаза узнает такой сайт и метилирует со-
Репликация ДНК
Неметилированный
сайт
ответствующий остаток новообразованной цепи, наследственно закрепляя
таким образом полностью метилированное состояние данного сайта. Поскольку
этот фермент узнает только полуметилированные сайты, положение
неметилированных сайтов также закрепляется наследственно.
16. Регуляция экспрессии генов у эукариот
229
кализации генов, для которых наблюдается изменение уровня экспрессии.
Появление в области генов, расположенных в районах изменения структуры
хроматина, новых участков, чувствительных к расщеплению ДНКазой I, как
правило, сопровождается по крайней мере частичным деметилированием сайтов
Cm5CGG, находящихся вблизи или внутри соответствующих генов.
Известна также корреляция между протеканием вирусной инфекции и
процессами метилирования ДНК. Линия клеток, трансформированных вирусом
