Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
221
Дополнение 16.1. Исследование структуры хроматина
Структуру участков хроматина, содержащих гены, клонированные в составе
рекомбинантных векторных ДНК, можно изучать непосредственно на интактных
ядерных ДНК, в качестве критерия используя различия в чувствительности к
действию нуклеаз. Участки ДНК, входящие в область "открытых" хроматиновых
структур, более доступны нуклеазной атаке, чем участки, существующие в
виде более компактных структурных образований.
Для обнаружения таких участков ДНК проводят мягкое разрушение клеток, не
сопровождающееся разрушением ядер. Аликвоты ядерной фракции подвергают
действию возрастающей дозы нуклеазы типа ДНКазы I, которая вносит
одноцепочечные разрывы в двухцепочечную ДНК. После этого из каждой
аликвоты выделяют ДНК и подвергают ее расщеплению определенной
рестриктазой. Полученные препараты анализируют с помощью электрофореза и
гибридизации по Саузерну
Рис. 16.11. Обнаружение участков хромати-новой ДНК, чувствительных к
расщеплению ДНКазой I. Рестрикционный фрагмент, выявляемый по
гибридизации с зондом 1, устойчив к ДНКазе I, вероятно, ввиду защитного
действия структуры соответствующего участка хроматина. Напротив, другой
рестрикционный фрагмент, гибридизующийся с зондом 2, чувствителен к
действию ДНКазы I. С увеличением концентрации фермента в реакционной
смеси количество соответствующего фрагмента убывает.
2.
Разрушение клеток в гомогенизаторе тканей
V
Выделение ядер центрифугированием
3. Расщепление О
ДНКазой I (мкг/мл)
4. Выделение ДНК и расщепление рестриктазой
V
V
5. Анализ набора фрагментов ДНК с помощью электрофореза в геле, переноса
по Саузерну и гибридизации с радиоактивными зондами 1 и 2
Зонд 1
Зонд 2
6. Радиоавтография
ДНКаза 1 (мкг/мл)
t
->
О 0,2 0,4 0,6
0,2 0,4 0,6
222
Экспрессия генетического материала
(см. гл. 9). В качестве зонда для локализации искомых рестрикционных
фрагментов после электрофореза используют клонированные радиоактивно
меченные фрагменты соответствующих генов.
Обработка ДНКазой I не приводит к изменению положения рестрикционного
фрагмента ДНК на электрофореграмме, поскольку точки расщепления ДНКазой I
случайным образом распределены по обеим цепям ДНК. Если участок ДНК
оказывается доступен действию ДНКазы I (как в случае участка,
комплементарного зонду 2, рис. 16.11), то при увеличении
концентрации ДНКазы количество фрагмента в пробе и интенсивность сигнала
на радиоавтограмме падают. Такое поведение характерно для транскрипционно
активных областей ДНК. Участок ДНК, фрагмент которого гибридизуется с
зондом I, ведет себя в данных экспериментах аналогично участкам,
расположенным в неактивной области ядерной ДНК: количество фрагмента с
увеличением концентрации ДНКазы I практически не меняется, поскольку
соответствующий участок недоступен действию фермента.
Таким образом, рассмотренные выше подходы надежно свидетельствуют о
существовании в хроматине гиперчувствительных областей ДНК. Они позволяют
также выявить корреляцию между транскрипцией и возникновением
гиперчувствительных участков вблизи точки инициации транскрипции. В то же
время следует помнить, что обнаружение корреляции еще не означает
установления точной причинно-следственной связи событий. Лишь в некоторых
случаях с помощью генетического анализа удалось показать, что
последовательности гиперчувствительных участков ДНК действительно
необходимы для инициации транскрипции. Наиболее интересен пример
транскрипции гена Sgs4 Drosophila, о котором упоминалось в гл. 9. В 5'-
фланкирующей и структурной областях этого гена было выявлено пять
гиперчувствительных участков (рис. 16.12). Эти участки обнаруживаются
только в ДНК, выделенной из ядер клеток слюнной железы в стадии развития,
сопровождающейся активной экспрессией гена Sgs4. Известны мутанты,
которым не свойственна экспрессия этого гена. Соответствующие мутации
картируются в 5'-фланкирующей области гена. У двух типов мутантов
делетированы наиболее удаленные гиперчувствительные участки ДНК (рис.
16.12). В случае наиболее отдаленной делеции (Вег) налицо практически
полное отсутствие транскрипции гена Sgs 4. В хроматине клеток слюнной
железы у мутантов Вег обычными методами в районе гена
-480 -405 -330
-70
+30
BER
ORL
Рис. 16.12. Участки, гиперчувствительные к ДНКазе I в области 5'-конца
гена Sgs 4 и в предшествующей области ДНК из ядер клеток слюнной железы
Drosophila. Размеры серых кружков отражают относительную чувствительность
соответствующих участков к ДНКазе I. Фи-
Sgs 4
гурной скобкой отмечен весьма протяженный гиперчувствительный участок в
области-330. Внизу отмечены две делеции, упомянутые в тексте. (По
Shermoen A. W., Beckendorf S. К., 1982. Cell, 29, 601. Copyright 1982 М.
I.T.)
16. Регуляция экспрессии генов у эукариот
223
Sgs 4 не удается обнаружить гиперчувствительные участки, выявляемые в
норме, в том числе и те, которые локализуются вне области делеции.
Напротив, в случае делеции ORL уровень транскрипции гена Sgs 4 составляет
