Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
111
Чтобы определить, каким из этих способов реплицируется ДНК. надо уметь
отличать дочерние молекулы от родительских. Мезелсон и Сталь выращивали
Е. coli на среде, содержащей в качестве источника азота 15N. Тяжелый
изотоп азота l5N включался в состав ДНК и служил меткой. Для того чтобы
пометить изотопом 15N практически всю бактериальную ДНК, достаточно вести
культивирование на такой среде в течение двенадцати поколений. Молекулы,
содержащие 15N, можно отличить от молекул, содержащих более легкий,
обычный изотоп, по плотности, так как у ДНК с 15N масса одного нуклеотида
больше, чем у обычной ДНК. Молекулы ДНК с различной плотностью могут быть
разделены центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (рис.
4.14). В процессе центрифугирования молекулы ДНК собираются в том слое, в
котором плотность раствора равна их собственной плотности. ДНК клеток Е.
coli, выращенных на среде, содержащей 15N, имеет плотность 1,724 г/см3,
тогда как ДНК клеток, выращенных на обычной среде с изотопом 14N, имеет
плотность 1,710 г/см3. Смесь этих двух типов ДНК легко разделяется при
центрифугировании по плотности (рис. 4.14).
Аналогией, иллюстрирующей принцип центрифугирования в градиенте
плотности, может служить погружение подводной лодки. Регулируя количество
воды в балластных танках (баках), подводная лодка может зависать на
желаемой глубине, плотность воды на которой равна средней плотности
подводной лодки. Если набрать в танки больше воды, вытеснив
соответствующее количество воздуха, то плотность подводной лодки
увеличивается, и она погружается, попадая в слои более холодной воды с
большей плотностью. Когда плотность воды оказывается равной плотности
подводной лодки, лодка снова зависает на новой глубине.
В эксперименте Мезелсона и Сталя клетки, в течение многих поколений
культивируемые на среде с 15N, быстро переносили в среду, содержавшую
14N. Через определенные промежутки времени отбирали пробы растущей
культуры и в каждой из них определяли плотность ДНК. Результаты
представлены на рис. 4.15. После первого деления на среде с 14N плотность
ДНК культуры была промежуточной между [15N] ДНК и [14N] ДНК. После
второго деления на среде с 14N половина клеток имела легкую ДНК, а вторая
половина-ту же, что и в предыдущем поколении (промежуточную). После
третьего деления на среде с 14N 3/4 ДНК имело плотность, равную плотности
[14N] ДНК и 1/4 сохраняла промежуточную плотность. Соотношение между
числом генераций и распределением плотности ДНК в точности
соответствовало полуконсервативному типу репликации, предсказываемому
моделью Уотсона-Крика (рис. 4.15).
Кроме того, модель предсказывала, что ДНК с промежуточной плотностью
должна представлять собой гибридную двойную спираль, одна из цепей
которой содержит только тяжелый изотоп азота (N15), а другая-только
легкий. Мезелсон и Сталь нагревали ДНК промежуточной плотности в течение
30 мин при температуре 100°С, что, как уже было известно, изменяет
физические свойства молекулы, не разрывая ковалентных связей, и
обнаружили, что она превращается в две равные по объему фракции ДНК с
разными плотностями. Плотность одной из фракций, образовавшихся в
результате нагревания, совпадала с плотностью тяжелой ДНК, а другой-с
плотностью легкой ДНК (рис. 4.15).
in
Организация и передача генетического материала
Направление осаждения Возрастание плотности
Г Л
^чНеденатури рованная [15N] ДНК
Денатури-
рованная
нагреваниег
[l4N] ДН1
Денатурированная Денатурация нагреванием приводит к расщеплению
нагреванием двухцепочечной ДНК на отдельные цепи
.^[15К] ДНК
Денатурированная нагреванием гибридная ДНК
+
Денатурированная нагреванием [ '5 N] ДНК
Плотность
Рис. 4.15. А. Распределение плотности молекул ДНК, наблюдавшееся
Мезелсоном и Сталем после перенесения растущих клеток Е. coli из тяжелой
среды в легкую. Б. Схематическая интерпретация результатов,
представленных на А. ДНК, меченная 15N, и вновь синтезируемая ДНК,
имеющая 14N,
изображены разным цветом. В. Нагревание ДНК промежуточной плотности
превращает ее в одноцепочечную ДНК, содержащую две фракции, плотность
одной из которых совпадает с плотностью нагретой ДНК, меченной 15N, а
другой-меченной 14N.
4. Природа генетического материала
ИЗ
Из этого было сделано заключение, что ДНК промежуточной плотности,
образующаяся после первого деления в легкой среде, представляет собой
гибридную молекулу, состоящую из одной родительской цепи, содержащей
только тяжелый изотоп азота, и другой, вновь синтезированной дочерней
цепи, как это предсказывает модель Уотсона-Крика.
Аналогичные эксперименты проделывали с реплицирующейся ДНК множества
различных прокариотических и эукариотических организмов, и каждый раз
оказывалось, что ДНК реплицируется полуконсервативно. Эксперименты
Мезелсона-Сталя были первым доказательством справедливости модели
Уотсона-Крика. В настоящее время можно с уверенностью сказать, что
основные положения этой модели убедительно подтверждены и структура
