Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в
следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах.
Не удивительно, что новые эффективные методы исследований нашли
применение не только в фундаментальных исследованиях. Они оказывают
глубокое влияние на медицину, ветеринарию, селекцию животных, растений,
на микробиологическую промышленность. Приведем всего лишь несколько
примеров.
Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных
нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах,
узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповидноклеточной анемии
происходит замена АТ на ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодирующего
[J-цепь гемоглобина человека; замена происходит в сайте (CTNAG),
чувствительном к рестриктазе Dde I (рис. 9.19). Фрагменты ДНК,
возникающие под действием Dde I у здорового человека и больного
серповидноклеточной анемией можно сравнить с помощью метода гибридизации
по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена
(3-глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно
определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за
несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки,
взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают
анализу. Такая диагностическая процедура может производиться в тех
случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного
рецессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные
мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда
такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами
рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной
диагностике.
Новые методы работы с ДНК позволяют также значительно усовершенствовать
методы создания вакцин против различных вирусных заболеваний человека и
животных. Такие новые способы, включая клонирование и определение
нуклеотидной последовательности ДНК вируса, применяли при разработке
вакцин против ящура-одной из наиболее распространенных в мире тяжелых
болезней свиней и крупного рогатого скота. Современные вакцины,
приготовленные традиционным способом, используют "инактивированные" или
ослабленные препараты, которые, однако, иногда содержат патогенные
вирусы, что может приводить к вспышкам болезни. Кроме того, некоторые
штаммы вирусов при культивировании в лабораторных условиях не достигают
кон-
9. Методы работы с ДНК
289
Рис. 9.19. Исследование мутации серповидноклеточной анемии на уровне ДНК.
А. Нормальная и мутантная последовательности аминокислот и
соответствующие им последовательности нуклеотидов в ДНК. Б. Карта сайтов
рестрикции клонируемого зонда для участка гена р-цепи гемоглобина
человека. Широкой полосой изображен транскрибируемый участок ДНК, тонкой
линией-нетранскрибируемый участок на 5'-конце гена. В нижней части
рисунка показана локализация Dde I-сайтов на рестрикционной карте
нормальной и мутантной форм. В. Размеры Dde I-рестриктов ДНК из
нормальных клеток ((3(3) и клеток, гомозиготных по мутации
серповиднри^геточной анемии (|3 |3 ), определяли с помощью радиоактивного
зонда.
[Geever R. F. et al.
(1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8, 5081.]
Аминокислотная последовательность (кодоны 5, 6 и 7) и соответствующая
нуклеотидная последовательность
Нормальная
(3-цепь
Серповидно-клеточная (3 -цепь
Pro - Glu - Glu ССТ GAG GAG GGA CTC CTC
Pro - Val - Glu CCT GTG GAG GGACAC CTC
Сайт рестрикации Dde I подчеркнут
к
Q a
Д. X
D
Я
89
376
| 88 t 89
В
- 376
ШШ
центраций, достаточно высоких для вакцинации. Разработка синтетических
вакцин позволяет решить многие из этих проблем. Основным антигеном вируса
ящура является белок головки вируса VP1. Однако сам по себе этот белок,
выделенный в очищенном состоянии из вирусных частиц, или полученный из
клеток Е. coli, используемых при клонировании гена VP1, обладает слабым
антигенным действием и не может использоваться в качестве вакцины.
Определение нуклеотидной последовательности клонируемого гена позволяет,
зная генетический код (см. главу 12), легко определить полную
последовательность аминокислот в белке VP1. После того как полная
последовательность аминокислот известна, нетрудно химически синтезировать
более короткие полипептиды, обладающие сильными антигенными свойствами и
индуцирующими синтез антител против целых вирусных частиц.
290
Организация и передача генетического материала
Вследствие различия в механизмах экспрессии генов у прокариот и эукариот,
Е. coli может оказаться хозяином, мало подходящим для производства белков
эукариотических организмов. Поэтому разработаны методы получения векторов
для клонирования различных генов в клетках дрожжей - одноклеточных
эукариот. Эти клонирующие векторы получают из репликонов дрожжевых
клеток, так называемых 2ц-плазмид. Точки начала репликации этих векторов
взяты у плазмид 2ц и у pBR322, в результате чего они могут
