Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Возможность и вероятность трансформации у бактерий определяется в основном'двумя факторами: 1) степенью родства’до-нора и реципиента и 2) так называемой компетентностью клеток реципиента. Наиболее эффективна трансформация между штаммами одного и того же вида. Гораздо меньше вероятность межвидовой трансформации в пределах одного рода. Очень редки и обычно дискутабельны сообщения о трансформации в опытах с еще более отдаленными друг от друга бактериями. В свое время вероятность трансформации предлагали в качестве теста для оценки таксономической дистанции между изучаемыми штаммами и видами. Однако вмешательство второго фактора — компетент* ности и, более того, существование целых групп, в пределах которых пока не удалось получить феномена трансформации даже между близко рЬдственными организмами (микобактерии, пасте-реллы и др.) лишает этот тест универсальности. Кроме того, он не выдерживает конкуренции с описанными выше методами сравнения генетических нуклеиновых кислот по сплавляемости.
В популяции бактерий лишь небольшая доля особей может трансформироваться. У классических объектов трансформации — пневмококков, гомофильных бактерий, сенной палочки — она составляет 1—2% Или менее и лишь очень редко превышает 10%. Клетки популяции данной бактерии, способные к трансформации, называют компетентными. Компетентность находится в тесной зависимости от условий и фазы культивирования бактерий. Оптимальное их сочетание всегда индивидуально, хотя чаще отмечают большую компетентность в середине логарифмической фазы роста. Генотипически компетентные клетки не отличаются от некомпетентных. Пока трудно дать исчерпывающий ответ, чем именно Отличается фенотип компетентной клетки. Установлены особенности в составе и энзиматической активности оболочки компетентных бактерий. Так, например, отмечали более высокое содержание галактозамина. Полагают, что последний, замещая терминаль-
ные остатки ортофосфата (во фракции, содержащей тейхоёвую кислоту), снижает отрицательный заряд оболочки, облегчая проникновение ДНК. Проницаемость клеточной стенки компетентных бактерий связывают также с повышением активности литическйх энзимов типа М-ацил-мюрамил-/-аланин-амидазы, которые могут образовать «окна» в оболочке (Joung, 1967),.
Из числа многих внеклеточных факторов, оказывающих влияние на компетентность, отметим лизоцим, некоторые белки сыворотки и агент, появляющийся в среде, когда культура входит в фазу компетентности. Избирательно повреждая, внешнюю оболочку, лизоцим во много раз увеличивает число трансформантов в фазе логарифмического роста ряда бактерий. Казалось бы, это однозначно решает вопрос о природе компетентности. Однако очевидность утрачивается уже при рассмотрении действия белков сыворотки. Альбуминовая фракция резко стимулирует трансформацию у пневмококков и гемофильной палочки, хотя для роста этих бактерий она не нужна, и нет оснований предполагать повреждение ею оболочки бактерий.. Повышающий компетентность фактор из культуральной жидкости является, судя по всем накопленным данным, белком или (и) комплексом белков, в который входят литические энзимы культуры, освобождающиеся в этой фазе из распадающихся клеток. Для стрептококков описано выделение из среды культивирования относительно низкомолекулярного полипептида с сильно основными свойствами (pi =11), резко повышающего компетентность (Leonard, Cole, 1972). Общим для действия всех этих, да и других факторов, способных повышать число компетентных клеток, является то, что они не могут создать компетентность в культурах, для которых наличие трансформируем мых клеток вообще нехарактерно. Как справедливо указывает А. А. Прозоров: «...чтобы фактор компетентности подействовал На клетку, клетка должна быть уже готовой к этому воздействию» (А. А. Прозоров, 1966). Иначе говоря, мы еще не располагаем настоящим фактором компетентности (или полным комплексом таких факторов). Очевидно, что повышенная порозность оболочки бактерий, наступающая либо под влиянием литических энзимов, либо в силу отставания синтеза оболочки от темпа размножения культуры, лишь способствует трансформации. Действие же фактот ров, подобных альбуминовой фракции сыворотки, связывают с их влиянием на сорбцию ДНК Цитоплазматической мембраной — еле* дующим барьером на пути к хромосоме реципиента. Роль цитоплазматической мембраны в компетентности еще мало изучена. Нельзя, наконец, исключить из числа факторов компетентности какие-то особенности действия нуклеаз реципиента на свободную ДНК, оказавшуюся в цитоплазме хозяина.
Вопрос о природе компетентности является камнем преткновения всей теории и практики трансформации. Именно он существенно ограничивает возможности этого метода обмена веществом наследственности. Поэтому изыскание методов повышения компетентности особенно актуально.
Для проникновения ДНК в клетку важно, чтобы она была в нативном состоянии. Денатурированная ДНК способна вызывать трансформацию лишь в определенных узких условиях, ее эффективность гораздо ниже. Эта понятно, ибо денатурированная ДНК находится, как правило, в состоянии клубка с диаметром, заведомо большим, чем диаметр палочковидной упругой биспиральной молекулы нативной ДНК. Поэтому последняя должна легче проникать через оболочку. Для нативной ДНК пока не установлено четких ограничений по максимальному размеру: обычно эксперименты по трансформации ведутся с молекулами весом до 10—20*10®, однако описан и трансформирующий эффект молекул с весом порядка 200—400* 10®. Правда, в последнем случае происходит, по-видимому, частичное дробление этих хрупких гигантов на стадии проникновения или сорбции на мембранах. Нижний же предел размера ДНК определяется не столько проникновением, сколько средними и минимальными размерами цистронов. Вероятность того, что обломок ДНК весом менее 300 000 дальтон будет содержать неповрежденный цистрон, очень невелика. Напомним, что такой фрагмент способен кодировать полипептидную цепочку менее чем из 150 аминокислот и что, кроме того, дробление именно по краям цистрона наименее вероятно. Можно также представить себе и ряд других ограничений. В конечном счете, именно указанный минимальный вес описан как нижний предел для проявления существенной трансформирующей активности.
