Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕНОСА И ОБМЕНА ВЕЩЕСТВА НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ
Обмен вещества наследственности является важнейшей стороной процессов полового размножения. Исторически первым объектом генетических исследований явилась гибридизация животных и высших растений. Основой ее является сочетание хромосомы отцовского и материнского организмов, а также кроссинговер, обеспечивающий различные сочетания частей хромосом. Долгое время предполагалось, что половые процессы не существуют у примитивных организмов. Отсутствие относительно простого объекта крайне затрудняло исследования в этой области. Поэтому открытие у бактерий явления трансформации — Avery, McLeod, McCarthy в 1944 г., сексдукции — Lederberger и Tatum в 1946 г. и, наконец, трансдукции — Lederberger и Zinder в 1952 г. имеет значение не только как выявление простейших половых процессов у прокариотов, но и в плане отыскания эффективных методических путей для познания фундаментальных механизмов переноса и обмена вещества наследственности. Чрезвычайно плодотворным оказалось также изучение рекомбинации у еще более простых существ — бактериофагов, хотя ее нельзя рассматривать как половой процесс — это лишь эквивалент последнего.
Перенос и обмен вещества наследственности протекает в различных формах. Среди большого числа понятий и терминов, применяемых в этой области, генетическая рекомбинация или просто рекомбинация является наиболее общим. Она подразумевает различные устойчивые сочетания фрагментов вещества наследственности, образуемые при половых процессах или их эквивалентах и передающиеся потомству. Рекомбинация у вирусов — наиболее простой из этих процессов. Нужно учитывать, что простота эта относится главным образом к рекомбинирующим ДНК. Энзиматические же механизмы рекомбинации вирусов могут быть сложными за счет возможного использования вирусом энзимов клетки-хозяина. В силу особенностей методов гибридизации и клонирования наиболее удобным объектом оказались бактериальные вирусы — фаги. Чрезвычайно высокий темп их размножения (минуты — десятки минут), относительная простота отбора потомства одной вирусной частицы, а также
популяции, образовавшейся на одной клетке-хозяине, наличие удобных для регистрации генетических маркеров (по морфологии негативных колоний) и, наконец, высокая интенсивность рекомбинации— для Т-четных колифагов около 5 актов за генерацию — все это определило выбор именно фаговой модели. Методы и чисто генетические аспекты работы с фагами обстоятельно описаны во многих руководствах. Ведущие биохимики, микробиологи и генетики в сотнях лучших лабораторий мира всесторонне исследовали этот замечательный объект как таковой и как модель более сложных организмов. Однако только в течение последних пяти лет определился выбор между тремя наиболее вероятными механизмами рекомбинации фагов: 1) выборочным копированием (сору choice); 2) разрывом рекомбинирующих двуцепочечных молекул в строго одинаковых местах по обеим цепям сразу и последующим воссоединением отрезков из разных ДНК; 3) разрывом ДНК в местах близких, но не совпадающих ни в обеих цепях, ни в рекомбинирующих молекулах, опять-таки с дальнейшим перекрестным соединением. Наиболее простыми являются первые два гипотетических механизма (рис. 28), но оба они связаны с предположениями, которые по мере изучения процессов редупликации ДНК представлялись все менее и менее естественными. «Переброска» синтеза с одной матрицы на другую необъяснима с точки зрения закономерностей действия ДНК-полимеразы, изложенных в главе II. Так же точно очень трудно допустить координированные разрывы сразу по обеим цепям в точно совпадающих местах.
Для таких сложных образований, как хромосомы многоклеточных, предположение о включении каких-то специфических механизмов в месте синапса имеет определенную вероятность, но для вирусных ДНК оно представляется искусственным. Вместе с тем, принятие третьего механизма требует объяснения процессов заполнения брешей, которые неизбежно выявятся при воссоединении неровно и неточно «обрезанных» концов.
Первый механизм выборочного копирования был исключен опытами Meselson и Weigl (1964), Meselson (1964). Они воспользовались для этого диким штаммом фага X и штаммом, мутировавшим по двум признакам — размеру и виду негативных колоний. Предварительно было установлено генетическими методами, что локусы, определяющие эти признаки — mi и с, расположены близко друг к другу, причем так, что разрыв хромосомы между ними должен привести к образованию неодинаковых по длине фрагментов, составляющих около 0,85 и 0,15 хромосомы (рис. 29). Пометив ДНК дикого фага X тяжелыми изотопами О14 и N15, авторы одновременно заражали клетки диким и мутантным штаммами. При этом происходило образование рекомбинантов со смешанными характеристиками колоний — С+ mi и С mi+. Затем фаговые частицы из лизатов клеток разделялись градиентным центрифугированием. После разделения определялось содержание рекомбинантов в слоях с разной плотностью. Оказалось, что слои
с плотностью, составляющей около 0,9 от разности плотностей дикого и мутантного штаммовгсодержат относительно большую концентрацию рекомбинантов, С+/ш, а с плотностью около 0,1— рекомбинантов С/ш+ Это возможно лишь в том случае, если в образовавшейся популяции фагов есть рекомбинанты, возникшие в результате соединения не успевших редуплицироваться фрагментов хромосом дикого и мутантного штаммов, очень близких по размерам к предсказанным на основе картирования хромосомы генетическими методами (см. рис. 29). В противном случае доля тяжелой ДНК в этих рекомбинантах была бы мень-
