Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Наконец, М-нитрозопроизводные мочевины и гуанина рассматриваются далее особо как мутагены, которым присуща не только алкилирующая активность, но и ряд других механизмов действия.
Аналоги оснований. Идея «обмана» систем синтеза ДНК, искажения комплементации типовых оснований с помощью аналогов последних возникла уже на начальных стадиях современнного периода развития молекулярной биологии и оказалась весьма плодотворной. Применение аналогов оснований способствовало решению и ряда теоретических вопросов, и прикладных задач. В настоящее время мутагенная активность этих агентов (повышение вероятности мутаций до 2—3-10-2) представляется весьма скромной при сопоставлении с рядом других соединений, исследованных позже. Однако и сейчас они привлекательны как агенты со строго определенным механизмом действия, которые в то же время принципиально отличны от мутагенов, способных действовать на покоящуюся, нереплицирующую ДНК. Известно большое число аналогов оснований, но мы рассмотрим лишь два, с помощью которых выполнен ряд исследований; ставших классическими, — бром-урацил — БУ (часто в форме 5-бромдезоксиуридина БУДР) и 2-аминопурин — АП. Введение брома в положение 5 пиримидинового кольца смещает равновесие в реакции кето-енольного перехода. Обычно доля енольной формы ничтожна. Однако атом брома, притягивая электроны, резко увеличивает вероятность ее образования, в результате чего БУ может становиться комплементарным гуанину, т. е. ведет себя подобно цитозину:
Вг
• И. П. Ашмарин
При этом не следует думать, что БУ существует лишь в енольной форме. Значительная часть БУ ведет себя как тимин, но доля енольной формы становится существенной. Если БУ, входящий в состав новой цепи, находится в енольной форме, он спаривается с гуанином. При следующем акте репликации, если БУ опять будет в енольной форме, произойдет включение гуанина и мутации не возникнет. Если же в момент последующей репликации БУ окажется в кетоформе, то в новую цепь включится аденин и, в конечном счете, возникает транзиция с заменой ГЦ—*АТ. Если при вхождении БУ в новую цепь он будет в кетоформе, но в момент следующего акта репликации окажется в енольной форме, то произойдет замена АТ—*ТЦ. Возможные превращения с участием БУ можно представить так:
Исходная пара
Репликация
1-я 2-я 3-я конечная---пара
ГЦ-
енол ^ Г= —БУ'
енол БУ —
кето БУ =
= А
А — = Т — транзиция
АТ-
кето А = = БУ"
кето БУ —
енол БУ -
А = = Т — нет замены
— р -> Г — — Ц — транзиция
Более вероятным, как показывает опыт, является переход ГЦ-*АТ.
Механизм действия 2-аминопурина сводится к эффекту положения аминогруппы, при котором возможно спаривание и с тими-ном, и с цитозином:
СН* Н
ГУ
т
N—Н
N
1 и
N N
гг
-Nn^N n\
'к N
O-HN^
N
/
Н
I
И в этом случае замена оснований возникает лишь при условии, что в момент второй репликации спаривание АП пойдет с иным основанием, нежели при первой репликации. Здесь также возможны замены АТ—>ТЦ и ГЦ—кАТ, но несколько более вероятной оказывается опять-таки последняя.
Характерной особенностью мутаций, вызываемых аналогами оснований, является возможность полного обращения, реверсии по-
давляющего большинства из них — до 95—99%—под действием тех же агентов. По вероятности такой реверсии к аналогам оснований приближается из числа других точковых мутагенов лишь гидроксиламин. Заметно уступает им по этому признаку азотистая кислота, хотя и в этом случае возможна реверсия большей части мутантов. Значительно отстают алкилирующие агенты. Наконец, акридиновые мутанты практически не ревертируют под влиянием аналогов оснований. Все это подтверждает, что аналоги оснований вызывают только простые замещения — транзиции, причем этот механизм не «загрязнен» другими реакциями. Понятна поэтому возможность полной реверсии при посредстве тех же механизмов. Отличия обратимости других точковых мутаций служат косвенной мерой «чистоты» описанных выше механизмов. Очевидно, что значительная часть мутаций, вызванных алкилирующими агентами, и все акридиновые мутации не являются простыми замещениями.
Таким образом, изучение возможности обратных мутаций является весьма удобным способом для дифференциации соединений, обладающих различными механизмами действия. В свою очередь аналоги оснований особенно удобны и показательны в таких экспериментах для получения как исходных мутаций, так и ревер-тантов. Рассматривая обратные мутации, следует иметь в виду, что если обратная мутация принципиально и возможна, то вероятность ее намного уступает вероятности прямой. Это естественно, поскольку прямая мутация охватывает небольшую долю ДНК, в случае точковых мутаций изменяются лишь единичные основания на 105—10е нуклеотидов. Вероятность реверсии точковых мутаций под действием аналогов оснований обычно в 100—1000 раз меньше, чем прямых.
