Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ашмарин И.П. -> "Молекулярная биология, избранные разделы" -> 43

Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.

Ашмарин И.П. Молекулярная биология, избранные разделы — М.: Медицина, 1974. — 360 c.
Скачать (прямая ссылка): molekulyarnayabiologiya1974.djvu
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 164 >> Следующая

Еще ряд нуклеаз заслуживает здесь описания главным образом потому, что они являются важными инструментами при аналитических процедурах, направленных на установление нуклеотидной последовательности РНК и ДНК. К относительно универсальным, «всеядным» энзимам, позволяющим достигать очень глубокого расщепления и ДНК, и РНК, принадлежит эндонуклеаза микрококков (Staph, pyogenes). Ее универсальность проявляется также в способности атаковать и двуцепочечную, и одноцепочечную ДНК. Энзим характеризуется некоторой неспецифич-ностью и в другом отношении. Строгой эндонуклеазой он является до тех пор, пока в продуктах гидролиза не появляются олигонуклеотиды. В отношении последних обнаруживается экзонуклеазная активность. Безоговорочной является лишь специализация на расщеплении связей фосфорила с 5'-углеродом — так, что продукты^ гидролиза содержат остатки ортофосфата в З'-положении. В отношении природы оснований в полинуклеотиде энзим опять-таки не обладает специфичностью и лишь некоторое предпочтение оказывает остаткам аденозина и тимина. Микрококковая экзону-клеаза приобрела широкую известность как энзим, удобный для
довольно глубокого расщепления многих нуклеиновых кислот до мононуклеотидов и олигонуклеотидов.
Во многих отношениях близка к эндонуклеазе микрококков экзонуклеаза из селезенки. Как и первая, она атакует и ДНК," и РНК, расщепляя связь фосфорила с З'-углеродом. Однако, если первая является преимущественно эндонуклеазой, проявляющей экзонуклеазную активность на поздних стадиях гидролиза, то вторая, напротив, является главным образом экзонуклеазой, обладающей небольшой эндонуклеазной активностью по отношению к крупным олигонуклеотидам.
Важнейшим средством энзиматического расщепления РНК и ДНК для аналитических целей стала экзонуклеаза змеиного яда (Grotalus adamantus). Энзим имеет оптимум pH 8,6, отщепляет нуклеозид-5'-фосфаты, причем РНК он способен гидролизовать без какой-либо предварительной обработки, а ДНК — после воздействия нейтральной эндо-ДНК-азой I. Важным условием действия энзима является наличие концевой З'-ОН-группы. Если она замещена остатком фосфата, то необходимо предварительное его отщепление фосфомоноэстеразой. Этим, собственно, в значительной мере объясняется и эффект эндо-ДНК-азы I, в результате действия которой обнажаются З'-ОН-группы. Вообще, сочетание нуклеазы змеиного яда и эндо-ДНК-азы I является одним из наиболее эффективных средств полного расщепления ДНК на мононуклеотиды.
Весьма перспективным для использования в опытах по опре-^ делению нуклеотидной последовательности ДНК является энзим, который индуцируется фагом Р-3 сенной палочки. Эта экзо-ДНКаза отщепляет с З'-конца одноцепочечной ДНК только динуклео-. тиды.
Наряду со строгими ДНК-азами и, напротив, нуклеазами, не обладающими специфичностью к ДНК или РНК, существуют строгие РНК-азы. К ним относится один из наиболее изученных и широко применяемых в исследовательской практике энзимов — эндо-РНК-аза I из поджелудочной железы и ряда других тканей животных. Сейчас известен не только молекулярный вес РНК-азы (-—-14ООО) и аминокислотный состав (основной характер белка), но и все детали первичной структуры и конфигурации единственного полипептида, образующего энзим; третичная его структура фиксирована четырьмя дисульфидными связями. Одним из выражений жесткости структуры РНК-азы I является ее необычная устойчивость к денатурации и, в частности, к нагреванию, — сохранение активности при 100° С в течение 5 мин и др. Оптимум' pH для действия энзима находится в нейтральной области. Сущность реакций расщепления РНК рибонуклеазой I требует специального рассмотрения. РНК-аза I расщепляет связи фосфорила с 5'-углеродом, после чего следует замыкание связи фосфорила с 2'-углеродом «своего» рибозного остатка — так, что образуются 2', З'-циклические концевые нуклеотиды. Этот этап не являетсяч гидролитическим. Только в дальнейшем, гораздо медленнее, чем
первая реакция, происходит гидролитическое расщепление цикла с образованием обычного З'-фосфатного остатка. Такой механизм расщепления нуклеиновых кислот не является общим для нук-леаз. В случае ДНК-аз он вообще невозможен из-за отсутствия 2/-ОН-группы в дезоксирибозе. Некоторые РНК-азы также не вызывают циклизации. Поэтому различают циклизующие и нецик-лизующие РНК-азы. Общая схема процесса для РНК-азы I представлена на схеме 6. На схеме 6 показана также определенная
Пур Пир Пир Пур Пир Пур Пур Пир Пур
5'\
К чф| I N N I N N к1
ф ф ф Ф ф
\ \ \ \ \ \ \ \
ч
3
\
Пир
Vt7 0
I s'
ч I "О
Jhoh
он
Пур
Схема 6. Схема процесса расщепления РНК рибо-
нуклеазой 1.
специфичность РНК-азы I в отношении выбора нуклеотидных остатков, между которыми расщепляется связь: энзим расщепляет 5'-связи фосфорила, связанного с З'-углеродом пиримидинового нуклеозида (т. е. стоящего справа от пиримидинового остатка). При этом необязательно расположение атакуемой межну-клеотидной связи во внутренних участках цепи — может отщепляться и соответствующий концевой мононуклеотид, т. е. РНК-аза I не является строгой эндонуклеазой. Однако избирательность энзима в отношении связей, образуемых пиримидиновыми нуклеозидами, не абсолютна. Следует отметить неспособность РНК-азы I расщеплять биспиральные РНК или цепи РНК, образующие смешанные биспиральные молекулы с комплементарными цепями ДНК. Это служит основой одного из приемов
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 164 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed