Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Сейчас появились первые сообщения о существовании РНК-ли-газ. Так, колифаг Т4 индуцирует образование энзима, сшивающего 5'- и З'-концы линейной молекулы полиаденилата и превращающего ее, таким образом, в кольцевую молекулу (Silber et al.,
1972).
СИНТЕЗ IN VITRO БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДНК
Лучшим критерием зрелости наших знаний о механизмах редупликации является воспроизведение ДНК, вполне идентичных природным и обладающих поэтому характерной биологической активностью. Однако эта задача оказалась очень трудной. Первые успехи в этом направлении наметились при редупликации фрагментов ДНК бактерий, обладающих трансформирующей активностью (о феномене трансформации см. в главе V). Наиболее же доказательным явился цикл исследований в лаборатории Kornberg, позволивший синтезировать in vitro хромосому колифага фХ’174 (Gulian, Kornberg, Sinsheimer, 1967). Последняя представляет собой одноцепочечную ДНК с молекулярным весом 1,7 * 10е даль-тон и обладает инфекционной активностью, т. е. в определенных условиях способна, подобно целому фагу фХ174, заражать протопласты Е. coli и вызывать их гибель. На матрице кольцевой ДНК фага — так называемой « + » цепи, или « + » кольце, с помощью ДНК-полимеразы синтезировалась комплементарная «—» цепь. Источником затравочных олигодезоксирибонуклеотидов являлись экстракты из озвученных клеток Е. coli, энзимы в которых инактивировались кипячением. Синтез, следовательно, протекал по схеме 16 рис. 14. Замыкание дочерней «—» цепи в «—» кольцо достигалось с помощью лигазы Е. coli. Значительные трудности возникали на этапе разделения « + » и «—» колец. Для этого на предшествующей стадии тимидинтрифосфат замещался бромдез-оксиуридинтрифосфатом, в результате чего «—» кольцо утяжелялось. Однако этого было недостаточно, чтобы при последующей денатурации разделить кольца, так как они закручены друг на друга. Поэтому производилась обработка небольшими количествами нуклеазы— так, что в части молекул оказывалось разор-1
ванным только одно из колец —« + » или «—». Тогда после денатурации и ультрацентрифугирования в градиенте плотности удавалось выделить часть «—» колец, оставшихся неразорван-ными. Далее, уже на матрице «—» кольца, вновь повторялись все описанные выше операции и в результате образовывалось снова « + » кольцо, неотличимое от исходного ни по размерам, ни по ин-фекционности. В свою очередь, оно могло при необходимости служить матрицей для повторения всех изложенных стадий синтеза. Получение in vitro полноценной хромосомы даже столь просто устроенного живого существа, как фаг <рХ174, является ярким доказательством справедливости основных закономерностей, установленных молекулярной биологией в отношении матричного синтеза нуклеиновых кислот. Вместе с тем, нетрудно заметить, что в представленной схеме синтеза хромосомы фага есть операции искусственного разделения « + » и «—» колец при посредстве введения неприродного аналога тимидина, которые, очевидно, не повторяют процесса, протекающего in vivo.
Синтез инфекционной ДНК фага <рЛ74 вновь демонстрирует недостаточность ДНК-полимеразы, матричной ДНК и нуклеозид-трифосфатов для полного воспроизведения даже относительно простой целой молекулы одноцепочечной ДНК. Необходима еще ли-газа и затравочные олигодезоксирибонуклеотиды. Уже упоминалось, что in vivo при синтезе многих ДНК роль затравки выполняют олигорибонуклеотиды. Это показано применительно к фагам М-13 и фЛ74 (Wickner, 1972; Schekman et al., 1972), к бактериям (Sugino et al., 1972) и высшим организмам (Stavria-nopulos et al., 1972). Следовательно, может быть, необходимо участие не только ДНК-, но РНК-полимеразы. Как указывалось выше, для инициации синтеза на матрице двуцепочечной ДНК обязательно образование насечки эндонуклеазой — никазой. Наконец, наиболее экономичным представляется синтез ДНК с «оттеснением» одной из старых цепей по 6-му варианту схемы 3. Это требует участия описанного выше специализированного белка, раскручивающего двойную спираль. Приведенный перечень уже насчитывает пять различных белков, ДНК-матрицу и нуклеозид-трифосфаты. Мы не указываем пока также ряд других факторов, которые необходимы для синтеза ДНК, находящейся в составе таких сложных образований, как хромосомы (особенно высших организмов). Они будут рассматриваться в разделе «Редупликация хромосом» (глава VI).
Таким образом, получением простейших биологически активных ДНК in vitro доказывается правильность основных представлений о механизмах синтеза ДНК,, накопленных к настоящему времени. Вместе с тем, системы полной редупликации даже таких ДНК включают целый ряд энзимов и других факторов, помимо полимеразы и НТФ. Поэтому, считая ДНК-полимеразу главным энзимом матричного синтеза, следует оценивать системы синтеза ДНК в целом как сложный комплекс белков и небелковых соединений, . : : -
МАТРИЧНЫЙ СИНТЕЗ РНК,
ТРАНСКРИПЦИЯ
На матрице двуцепочечных ДНК синтезируются все или, во всяком случае, подавляющее большинство РНК животных клеток, бактерий и ДНК-содержащих вирусов. На матрице двуцепочечных РНК образуются одноцепочечные РНК ряда вирусов.
