Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
с одной стороны, высоким и специфическим сродством к ДНК в зоне оператора (/Сй^10~13М), а с другой стороны, к субстрату (субстратам) тех реакций, которые катализируются энзимами, кодируемыми структурными цистронами Lac-оперона. Срок полураспада репрессора невелик и измеряется, видимо, минутами, но
CL
О
н
. I
та х:
Я
со
о.
о
2
Хромосома
Регуляторный ген I
мРНК
Рибосомы О о* е
*
<
=f
*
Рецепторный белок для цАМФ
Промотор
Олератор
Цистрон Z-j5 галактозидазы
Цистрон Y -пермеазы
Цистрон Х(а) -тиогалактозид-трансацетилазы
Индуктор
(например,
лактоза)
Неактивный комплекс репрессора с индуктором
Продукты
превращения
субстрата
Фактор терминами р
Схема 19. Схема регуляции синтеза Q-галактозидазы (по Жакобу и Моно,
19641 De Crombrugghe et al., 1971, и др.).
он вырабатывается непрерывно, и обычное состояние оператора — блокированное. Взаимодействие с субстратом, благодаря аллосте-рическому эффекту, так изменяет структуру репрессора в целом, что он теряет способность присоединяться к оператору. Поэтому появление в системе субстрата, связывающего репрессор, должно
включать оперон. Выработка энзимов, разлагающих и изменяющих субстрат, будет продолжаться до тех пор, пока концентрация последнего не снизится настолько, что прекратится связывание репрессора, и он вновь блокирует оператор (Bourgeois, 1971).
Лучшим критерием справедливости изложенных представлений о системе является ее воспроизведение in vitro из отдельных компонентов. Соответствующие эксперименты, осуществленные De Crombrugghe и сотр. (1971), были проведены на системе, содержащей изолированную область ДНК кишечной палочки с Lac-опероном, РНК-полимеразу (с a-фактором), очищенный репрессор, предшественники для синтеза РНК, а также отдельные дополнительные компоненты, необходимость в которых хотя „ и не следует из гипотезы Jacob и Monod, но и не противоречит ей по существу. К последним относится, во-первых, р-фактор, обеспечивающий терминацию транскрипции оперона. Он уже описывался в главе II как обязательный участник транскрипции в условиях, приближенных к существующим in vivo. Во-вторых, в систему вводился комплекс из циклического аденозинмонофос-фата (цАМФ, 3’, 5’-АМФ) с очищенным рецепторным белком, специализированным на связывании цАМФ. Этот комплекс влияет на взаимодействие промотора с РНК-полимеразой и связан с другой, более общей системой регуляции, которая будет описана ниже и которая опять-таки не меняет существа схемы Жакоба и Моно, а лишь определяет ее место в иерархии регуляторных механизмов. При введении в раствор, содержащий все перечисленные компоненты, индуктора начинался синтез мРНК. Заметим, что природный субстрат — лактоза не является непосредственным индуктором, т. е. агентом, непосредственно связывающим репрессор. Как показано недавно, лактоза, проникнув в клетку, взаимодействует с р-галактозидазой, следовые количества которой всегда присутствуют в клетке даже с репрессированным Lac-one-роном. При этом она частично превращается в аллолактозу. Отличие последней от лактозы состоит лишь в том, что галактоза в ней связана с глюкозой не через 4-й, а через 6-й углеродный атом. Однако сродство к Lac-репрессору аллолактозы является очень высоким, и уже при концентрации ее 10~5М наступает индукция синтеза р-галактозидазы (Jobe, Bourgeois, 1972). Кроме природных субстратов, некоторые другие соединения также способны связывать репрессор и индуцировать синтез энзимов Lac-оперона. Так, широко используется при исследовании Lac-оперона изопропилтиогалактозид. Его высокое средство к репрессору было в свое время использовано для выделения последнего. Ничтожность концентраций репрессорного белка в клеточных экстрактах и явилась причиной столь позднего осуществления прямых экспериментов, подтвердивших схему Жакоба и Моно. Сейчас известно, что каждая клетка кишечной палочки содержит лишь 10—20 молекул репрессора. Одна молекула репрессора связывает три молекулы индуктора. Весь оператор блокируется одной молекулой репрессора (тетрамером). Показано, что репрессор,
связавший индуктор, действительно теряет сродство к ДНК. Установлены константы диссоциации комплекса репрессор-ДНК и ре-прессор-индуктор.
Значение исследований, выяснивших механизмы регуляции оперона, очень велико не только потому, что системы этого типа широко распространены у бактерий и что существование их возможно у эукариотов. Очень важно, что основой системы оказалось узнавание белком участка ДНК. Поскольку репрессор является свободным от какой-либо примеси нуклеиновых кислот, невозможно привлечь для объяснения специфичности идеи Bonner и сотр. о наличии в таких комплексах векторной РНК. Если учесть также данные о белковом репрессоре Д.-фага и обширные 1 материалы об узнавании аминоацилсинтетазами своих тРНК (глава IV), то становится очевидным широкое распространение этой формы специфического взаимодействия. Остается, однако, неясной его химическая основа. Трудно, хотя и возможно, представить себе такие вариации структуры белка, которые позволяли бы различать линейные сочетания нуклеотидов. Поэтому и в отношении индивидуальных тРНК, и в отношении ДНК особенно интенсивно развиваются идеи о решающей роли специфической третичной конфигурации этих соединений в зонах взаимодействия с узнающим белком.. В главе VI уже рассматривались идеи Gierer (1966) и Crick (1971) о ветвистой, отростчатой структуре ДНК в зонах взаимодействия с регуляторным белком (см. рис. 38). Сейчас появились прямые свидетельства существования в акцепторных зонах ДНК симметричных «шпилек». Они могут возникать в участках, где последовательность оснований на одной цепи не только комплементарна таковой на другой цепи, но полностью ее; повторяет при прочтении с противоположного конца участка (так называемые палиндромы).
