Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
меразы, действующей в направлении 5’-*-3’. Один из путей к разрешению указанных противоречий был определен открытием Okazaki и сотр., показавших, что меченые предшественники включаются при репликации хромосом сначала в короткие отрезки ДНК, синтезируемые полимеразами в направлении 5’-*-3’ на обеих цепях, и лишь в последующем объединяются в цепи, соизмеримые с синтезированным участком хромосомы (Okazaki et al., 1968). Объединение синтезированных фрагментов ДНК в единую цепь осуществляется, видимо, лигазами и ДНК-полимеразами, застраивающими «бреши». Эти реакции особенно требовательны к источникам энергии и, в частности, находятся в специфической зависимости от наличия АТФ (Pisetsky et al., 1972). Кроме того, оказалось, что при репликации хромосомы ощутимая доля ДНК находится в денатурированном состоянии. Возле множественных точек инициации в синтезируемой ДНК сохраняются некоторое время вкрапления РНК—по 50—100 нуклеотидов. Это та РНК, с синтеза которой начинается репликация ДНК in vivo (Sugino et al.,
1972, и др.). Позже эти отрезки элиминируются энзимами репарации (гл. V). Широкое участие лигаз в процессе синтеза ДНК in vivo хорошо объясняет относительно высокое их содержание в клетке (2000 на клетку кишечной палочки), а также тот факт, что in vivo, в отличие от синтеза in vitro, требуются дополнительные количества АТФ в качестве источника энергии лигазной реакции. Правда, невозможно полностью отнести всю АТФ, потребляемую при синтезе in vivo, за счет лигазной реакции. Этот последний факт еще ждет своего истолкования. В результате наиболее широкое признание получили две следующие модели процесса.
Первая модель, иллюстрируемая рис. 44, является развитием гипотезы, иллюстрированной ранее схемой 3 (Kornberg, 1969; Gillian, 1971). Как видно, кроме действия ДНК-полимеразы, она требует периодического действия эндонуклеазы и лигазы. Без первой невозможно ни образование начальной насечки, ни продолжение синтеза после завершения репликации на ответвлении. Лигаза же необходима для сшивания фрагментов новой цепи на ответвлении. Если представить себе кольцевую хромосому, то в конечном счете такой процесс завершается полной редупликацией. Модель объясняет упомянутые данные о фрагментарности новой ДНК на начальных этапах синтеза и о наличии одноцепочечных участков. В хорошем соответствии с моделью находятся данные о том, что образующиеся на начальных стадиях редупликации отрезки одноцепочечных ДНК делятся на две категории по размеру. Можно полагать, что большие образуются при репликации нити 3’-+-5’, а меньшие — при репликации противоположной нити (Olivera, Воп-hoffer, 1972). Однако модель не требует одновременного участия многих молекул ДНК-полимеразы в репликации цепи 3’-»-5’, т. е. в направлении движения «вилки». Это затрудняет объяснение высокой скорости редупликации хромосомы. Более вероятно, что этот механизм является элементом какой-то более сложной си-
стемы. С этой точки зрения и нужно оценивать электронномикроскопические подтверждения данной модели, полученные Wolfson и Dressier (1972).
Вторая модель (Haskell, Dawern, 1969) и ряд более поздних модификаций позволяют истолковать редупликацию хромосомы как результат действия большого числа ДНК-полимераз на соседних участках с последующим слиянием образующихся разветвлений. Внешне это должно привести к характерной картине редупликации со все увеличивающимися участками раздвоения хромосомы. Схема процесса, представленная на рис. 45, состоит: а) из стадии первичных насечек на противоположных цепях в несовпадающих участках; б) стадии синтеза цепей ДНК от З'-краев насечек во встречных направлениях с оттеснением противоположной цепи (возможно, с участием упоминавшегося выше «расплетающего» фактора); в) образования повторных насечек эндонуклеазой в начальных точках образования новых цепей и частичного расширения насечек за счет отщепления экзонуклеазой небольшой части новой цепи; г) соединения лигазой 5'-концов оттесненных цепей с З'-краями насечек; д) продолжения роста новых цепей и, при встрече с концами новых цепей из другой аналогичной зоны синтеза, объединения с помощью лигазы. При всех достоинствах этой модели, объясняющей все указанные выше противоречия между картинами редупликации хромосом и закономерностями действия ДНК-полимераз, нельзя не отметить некоторой искусственности стадии «в», так как неясно, почему разрыв должен вновь произойти именно в начальной точке. Есть прямые экспериментальные данные, подтверждающие недолговечность ковалентной связи вновь синтезируемой цепочки с краем насечки (Stein, Hanawalt,
1972). Можно полагать, что в хромосоме действительно существует ряд определенных участков ДНК, в большей мере подверженных действию нуклеаз и ряда внешних факторов. Постоянное же возникновение и сшивание насечек на цепях ДНК является, по-видимому, нормой функционирования хромосомы.
Заметим, что схема Haskell и Davern и ей подобные не предполагают обязательной однонаправленности, полярности редупликации ДНК в хромосоме. Это хорошо согласуется с представлениями
