Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Линейный участок S-образной кривой отражает кинетику распада основной массы эритроцитов. Но и в этой фракции есть группа клеток, гемолиз которых происходит со скоростью, превышающей скорость распада любой другой группы данной популяции эритроцитов. Точка “2”, расположенная примерно в середине кривой, соответствует времени распада эритроцитов, происходящего с максимальной скоростью (vmax). Она соответствует положению максимума дифференциальной кривой.
Промежуток времени до начала разрушения самых нестойких клеток (точка “1”) до конца процесса (точка “4”) представляет собственное время гемолиза. Время, прошедшее с момента введения гемолитика в кювету до выхода кривой на плато, — общее время гемолиза. Иногда удобнее пользоваться временем половинного гемолиза t60 (точка “3”). Это время, за которое происходит распад 50 % эритроцитов. При исследовании кинетики гемолиза эритроцитов, индуцированного действием химических агентов, используются гипоосмотические растворы этих соединений с различной концентрацией в 0,55 % NaCl.
6.6. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПИДНОГО СОСТАВА ЭРИТРОЦИТОВ
При изучении биомембран обычно имеют дело с относительно небольшими количествами липидов, поэтому для их разделения чаще всего используют метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силикагеле, позволяющий проводить и качественный, и количественный анализ липидов различных классов. ТСХ осуществляют в тонком слое силикагеля, нанесенном на подложку — стеклянную, пластиковую или алюминиевую пластинку. В качестве адсорбентов можно применять и другие вещества (оксид алюминия, сефарозу, целлюлозу). Силикагель может быть с кальциевой связующей добавкой (силикагель G) или без нее (силикагель Н). Для разделения липидов используют хроматографические камеры, стенки которых выстилают изнутри фильтровальной бумагой для ускорения насыщения ее парами растворителя. Камеру готовят предварительно (примерно за 1 ч или более до эксперимента), залив в нее достаточное количество растворителя на глубину около 1,5 см. Фильтровальная бумага, выстилающая стенки камеры, должна пропитаться растворителем. Необходимо плотно закрывать камеру крышкой (если необходимо — использовать вазелиновую смазку). В камеру обычно помещают одновременно не более двух пластинок так, чтобы поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бумаги, а слои адсорбента находились на максимальном удалении друг от друга. Слой адсорбента не должен соприкасаться с боковыми стенками камеры.
Для лучшего разделения липидов рекомендуют активировать хроматографические пластинки, прогрев их при 110 °С в течение 30 мин. Исследуемые образцы в полярном растворителе наносят на расстоянии около 2,5 см от края пластинки в виде полос или пятен при помощи микропипетки с тонким наконечником. Прежде чем начинать разделение, необходимо убедиться, что растворитель полностью испарился из нанесенных образцов. Уровень растворителя в камере должен быть примерно на 1 см ниже уровня нанесенных образцов. Разделение заканчивают, когда фронт растворителя доходит до уровня на 1—2 см ниже верхнего края пластины. Последнюю вынимают из камеры, осторожно отмечают карандашом фронт растворителя и высушивают в вытяжном шкафу.
При разделении смеси липидов сложного состава проводят двумерную хроматографию с использованием двух систем растворителей. Для этого образец наносят в одном углу пластинки и проводят разделение в первой системе растворителей» причем пятна липидов располагаются вдоль одного края пластинки. Ее высушивают, поворачивают на 90° (пятна должны располагаться внизу) и проводят разделение во второй системе растворителей. Все классы липидов нельзя разделить в одной системе растворителей. Поэтому выбирают систему растворителей для разделения определенного класса липидов. В случае полного анализа липидов используют несколько систем растворителей.
Лабораторная работа № 14
Определение фосфолипидов эритроцитарных мембран методом тонкослойной хроматографии
Материалы и оборудование: хлороформ, метанол, бензол, силикагель КСК или Н, стеклянные пластинки 6x6 см (9x12 см), активированный гипс (лли карбонат натрия). 25 %-ный водный раствор аммиака, ацетон, ледяная уксусная кислота, серная кислота, бутанол, нингидрин, раствор Драгендорфа, 42%-ная хлорная кислота, молибдат аммония, аскорбиновая кислота, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, центрифуга, роторный испаритель, хроматографическая камера, шаровая мельница, водяная баня, фотоэлектроколориметр КФК-3.
Ход работы
Получить хорошо отмытые эритроциты по методике, описанной в лабораторной работе №1.5 мл отмытых эритроцитов обработать 15 мл смеси хлороформ-метанол (1:2), Смесь перемешать стеклянной палочкой и оставить в холодильнике на 10—12 ч, затем отцентрифугировать при 5000 об/мин и отделить супернатант и поместить его в холодильник. Осадок реэкстрагировать
19 мл смеси хлороформ—метанол—вода (1:2:0,8) и снова центрифугировать при тех же условиях. Супернатанты, полученные в результате двух экстракций, разбавить 10 мл хлороформа и 10 мл воды, В результате образуется двухфазная система, нижний слой которой состоит из хлороформа с растворенными в нем липидами, свободными от загрязнений, а верхний — из смеси метанола и воды, содержащий водорастворимые нелипидные примеси. Отделить хлороформную фракцию, разбавить ее равным
