Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Артюхов В.Г. -> "Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами" -> 93

Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.

Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами — Воронеж, 2000. — 296 c.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani2000.pdf
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 113 >> Следующая

Ход работы
Получить препарат мембран эритроцитов по методике, описанной в лабораторной работе № 1. В пробирки для определения общей АТФазной и М?2+-АТФазной активности внести по 1 мл суспензии мембран. В контрольные пробы вместо мембран внести 1 мл трис-HCl буфера. Добавить в пробирки для определения Mg2+-АТФазной активности по 0,3 мл строфантина (0,025 %), в контрольные и опытные пробирки для определения общей АТФазной активности - по 0,3 мл буфера, перемешать и через
30 мин в каждую пробирку внести по 1 мл инкубационной среды. Она содержит: 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л КС1, 3 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л ЭДТА, 5 ммоль/л АТР, 50 ммоль/л трис-HCl буфер (pH 7,4). Далее термостатировать содержимое пробирки в течение 1 ч при 37 °С. Реакцию остановить добавлением 0,5 мл 20 %-ной трихлоруксусной кислоты. Белок удалить центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин.
Количество образующегося фосфата определяют по методу с применением аскорбиновой кислотой, который включает использование следующих реактивов:
а) аскорбиновая кислота — 10 %-ный раствор;
б) молибдат аммония — 0,42 %-ный раствор, приготовленный на 1 н серной кислоте;
в) смесь, состоящая из одного объема раствора (а) и шести объемов раствора (б). Готовится непосредственно перед работой и хранится в течение дня в ледяной бане.
К 0,9 мл исследуемого раствора, содержащего 0,03 —
0,2 мкмоль неорганического фосфата, добавить 2,1 мл реактива (в). Перемешать и инкубировать 20 минут при 45 “С или 60 мин при 37 °С. После охлаждения измерить величину оптической плотности при 620 нм против контрольной пробы, содержащей вместо исследуемого раствора бидистиллированную воду. По разнице между полученными значениями общей АТФазной и Mg2+-АТФазной активности найти активность Na+, К+-АТФазы эритроцитарных мембран с помощью калибровочного графика.
Для построения калибровочной прямой в пробирки налить по
0,15; 0,30; 0,50; 0,70 и 0,90 мл стандартного раствора неорганического фосфата, содержащего 0,23 мкмоль/л фосфата (КН2Р04) в 1 мл. Довести объем в каждой пробирке до 1 мл бидистиллиро-ванной водой и далее обрабатывать, как указано выше. Зарегистрировать оптическую плотность проб и полученные данные изобразить графически, откладывая по оси абсцисс содержание фосфата в пробе, а по оси ординат — оптическую плотность при 620 нм.
Активность фермента рассчитывают по формуле:
А - ('ДРобщ -“APMg)'106 Kjt-31
где АВобщ = ВоСщ~ DK — разность величин оптической плотности раствора для определения общей АТФазной активности и контрольного раствора; ADMg = DM(j - DK — разность величин оптической плотности раствора для определения М?2+-АТФазной активности и контрольного раствора; К — калибровочный коэффициент, определяемый по формуле: К = — (D в абсолютных величи-
с
нах для определенной концентрации, с — значение концентрации); j — количество белка в пробе; t — время инкубации (мин);
31 — молекулярная масса фосфора.
Активность Na+, К+-АТФазы выражают в нмоль Рп/мг (белка) в мин или в мкмоль/л Рп/мл теней в час.
Лабораторная работа № 9
Изучение УФ~индуцированных изменений функциональных свойств Na+, К+-АТФазы эритроцитарных мембран
Материалы и оборудование: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, строфантин, ЭДТА, АТР, трис-HCl буфер (pH 7,4),
трихлоруксусная кислота, термостат, аскорбиновая кислота, мо-либдат аммония, однозамещенный фосфат калия, сульфат железа, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, установка для УФ-облучения биообъектов, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1.
Один объем (3 мл) суспензии мембран эритроцитов использовать в качестве контрольного образца и разлить по трем пробиркам, второй (9 мл) — разделить на три части (по 3 мл) и подвергнуть воздействию УФ-света в дозах 0,75; 2,27; 3,78 кДж/м2 при помощи установки для ультрафиолетового облучения биосистем. Облучение суспензии мембран эритроцитов в трис-HCl буферном . растворе (pH 7,6) проводят в стеклянной термостатируемой кювете (20±1 °С) при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки излучением лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1. Затем следует определить каталитическую активность Na+, К+-АТФазы в контрольных и опытных (при всех дозах облучения) пробирках по методике, описанной в лабораторной работе № 8. Данные занести в табл. 20.
Таблица 2 0
Ферментативная активность Na+, К^-АТФазы мембран эритроцитов человека после УФ-облучения
Образец Активность N а+, К+-АТФазы, мкмоль/л Активность
Рп/мл теней в час АТФазы, % от
1-е опреде 2-е опреде 3-е опреде a*sa
ление ление ление
Контроль 100 %
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed