Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Путем одноэлектронного окисления NADH и при восстановлении NAD+ может образовываться радикал NAD', взаимодействующий с кислородом с образованием супероксидиого анион-радикала 02~, поражающего белковую глобулу. Вместе с тем восстановленная форма кофактора обладает способностью дезактивировать Ю2: константа скорости тушения синглетного кислорода в системе CH3CN : D20 (4:1) — 7,5-107 л*(моль-с)-1; в D20 — 2,1-Ю7 л-(моль*с)~1. Следовательно, значение ее для NADH составляет 1,7-10"4 — 1,5-10-2 моль/л. NADH способен взаимодействовать с 02~, причем выявлено, что его окисление супероксидом идет быстрее, если кофактор образует.комплекс с ЛДГ: константа скорости окисления NADH в последнем случае по меньшей мере на 4 порядка выше таковой для свободного лиганда. Окисление NADH в активном центре фермента, по-видимому, должно происходить по цепному механизму и существенным образом изменять химические свойства кофактора.
Спектр поглощения комплекса ЛДГ (2-10"е моль/л) — NADH (2-10-8 моль/л) характеризуется двумя полосами поглощения с Хтак при 268 и 340 нм. Присутствие полосы с А,тоах 268 нм в спектре поглощения изучаемой системы можно объяснить индукцией структурных изменений молекулы апофермента путем присоединения кофактора, D. Scherr и соавт. (1973) исследовали спектральные свойства двойных комплексов, образующихся при взаимодействии аналогов или фрагментов NADH с ЛДГ из сердца свиньи, Комплексообразование вызывало спектральные изменения в области 280 нм, что указывает на участие в этом процессе
ароматических аминокислот. Авторы постулировали гидрофобный характер взаимодействия адениновой части коэнзима с апо-белком.
Таким образом, суммарный регистрируемый эффект изменения каталитической активности ЛДГ при ее УФ-облучении будет зависеть от соотношения процессов сенсибилизации и протекторного эффекта NADH. Защитное действие кофермента (Y = 13,8 и 50 %) может быть обусловлено реализацией следующих возможных процессов:
1) формированием более фоторезистентной конформации ЛДГ в комплексе с NADH по сравнению с апоферментом;
2) миграцией энергии с возбужденных аминокислотных остатков белка (в частности, триптофана) на кофермент;
3) акцептированием АФК (Ю2 и 02~);
4) экранирующим эффектом NADH в области длин волн 240— 280 нм.
Фотосенсибилизирующий эффект NADH по отношению к ЛДГ, по-видимому, объясняется образованием при УФ-облучении белка сольватированного электрона, акцептируемого NAD+, в результате чего в присутствии 02 возможен циклический процесс перехода NAD+ — NAD' с генерированием 02~ и других активных интермедиатов (NAD*, Н202). Кроме того, вследствие конформа-ционных переходов протомеров ЛДГ при фотоокислении NADH могут формироваться субъединицы, занятые одновременно восстановленной и окисленной формой кофактора, что существенно изменяет характер УФ-превращений, индуцируемых в системе фермент — кофермент.
Изучение роли АФК в процессах фотомодификации белка существенно дополняют исследования фотосенсибшшзированного метиленовым голубым (МГ) фотоокисления изофермента М4 ЛДГ. Механизм действия красителя связан с генерацией Ю2 или непосредственным взаимодействием возбужденной молекулы МГ с молекулой белка. Преобладание в системе тех или иных процессов зависит от соотношения концентраций биополимера и красителя в облучаемой системе.
Из анализа данных, представленных на рис. 58, я, следует, что облучение красным светом изофермента М4 (10-8 моль/л) в течение 15 мин с МГ (10~7 моль/л) не вызывает статистически достоверных изменений функциональных свойств ЛДГ по сравнению с уровнем активности белка, облученного в отсутствие красителя.
смг, моль/л
А, %
смг, моль/л
А, %
сМГ| моль/л
Рис, 58. Зависимость ферментативной активности ЛДГ (М4), облученной красным светом в присутствии азида натрия (3,2*10~3 моль/л), от концентрации метиленового голубого: а — концентрация фермента — 10~8 моль/л; б — 10"6 моль/л; в —10“7 моль/л; Ао — активность фермента, облученного в течение 15 мин красным светом без модификаторов; 1 — ЛДГ; 2 — ЛДГ+NaNg
Добавление МГ в концентрациях 10"6, 10"6 и 10"4 моль/л сопровождалось эффектом сенсибилизации: активность ЛДГ снижалась на 26,7±6,0; 11,04=1,8 и 17,4*2,6% соответственно. В присутствии NaN3 остаточная активность фермента после его облучения с МГ (10_б моль/л) составляет 87,8±3,6%, что свидетельствует об участии Ю2 в процессе фотоинактивации ЛДГ (10-8 моль/л).
При использовании растворов фермента (10-6 моль/л) максимальный сенсибилизирующий эффект МГ обнаруживается при его концентрации 10-6 моль/л и составляет 30,0±4,0 %, а остаточная активность белка, облученного в присутствии азида натрия, равна 90,3±2,4% (рис. 58, б). Аналогичные результаты были получены при исследовании фотосенсибилизированного окисления сердечной изоформы ЛДГ с участием МГ (10~в моль/л).
Для ЛДГ (10~7 моль/л) в присутствии МГ характер изменения функциональных свойств ЛДГ от концентрации красителя при облучении их смеси оказался иным: активность фермента убывает с ростом концентрации МГ, а степень инактивации достигает максимальной величины (23,2±4,5%) при концентрации сенсибилизатора 10"4 моль/л (рис. 58, в). При добавлении в систему азида натрия значения исследуемого параметра не отличались от таковых для ЛДГ, фотомодифицированной в свободном состоянии.
