Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Лабораторная работа М 21
Исследование УФ -чувствительности лактатдегидрогеназы
в присутствии некоторых модифицирующих агентов
Материалы и оборудование: ОД моль/л Na-фосфатный буфер (pH 7,4), пируват натрия, NADH, буферный раствор лактатдегидрогеназы из сердца свиньи или скелетных мышц свиньи, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы, стеклянные пипетки и пробирки, фильтровальная бумага, секундомер, установка для УФ-облучения биосистем.
Ход работы
I вариант
Объектом исследования является готовый препарат фермента, обессоленный путем гель-хроматографии на сефадексе G-25 (см. лабораторную работу № 18). Преподаватель выбирает один из вариантов эксперимента. В качестве модифицирующего агента используется раствор:
а) азида натрия (3,2-10“3 моль/л);
б) D-маннита (5,5*10~5 моль/л);
в) серотонина (1*10 "5 моль/л).
Затем необходимо провести определение функциональной активности:
1) нативного фермента (см. лабораторную работу № 18);
2) УФ-облученного в дозе 3,02 кДж/м2 свободного фермента;
3) фермента в присутствии модифицирующего агента;
4) фермента, У Ф -о б лученного в той же дозе в присутствии модификатора.
УФ-облучение образцов проводить согласно методике, описанной в лабораторной работе № 5. Данные представить в виде табл. 21.
Таблица 21
УФ-индуцированные изменения ферментативной активности лактатдегидрогеназы в присутствии модифицирующего
агента
Вариант опыта Ферментативная Активность ЛДГ, % от
активность ЛДГ, активности нативного
мкмоль/мин фермента
Нативный фермент 100 %
ЛДГ, УФ-облученная в
свободном состоянии
ЛДГ + модифицирующий
агент
ЛДГ, УФ-облученная в
присутствии химического
агента
На основании полученных результатов сделать заключение о причинах и характере изменений величин ферментативной активности ЛДГ при УФ-облучении белка в свободном состоянии и в присутствии модификатора. Какое действие может оказывать модифицирующий агент (азид натрия, D-маннит, серотонин) на структурно-функциональное состояние белковой молекулы при УФ-облучении растворов исследуемого фермента?
II вариант
В качестве объекта исследования используют препарат фермента, полученный из сердечной мышцы свиньи по методике, описанной в лабораторной работе № 17.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Опишите методику выделения эритроцитарных мембран из крови доноров.
2. Какие химические реакции лежат в основе определения содержания белка в мембранных структурах по методу Лоури?
3. Какие принципы лежат в основе определения ферментативной активности мембраносвязанных ацетилхолинэстеразы и Na+, К+-АТФа-зы?
4. Что представляют собой флуоресцентные зонды? Назовите параметры, используемые для характеристики флуоресцентных зондов.
5. Каковы направления использования флуоресцентных зондов в мембранологии?
6. Что представляет собой спектр люминесценции вещества?
7. Почему люминесцентные свойства флуоресцентных зондов изменяются при связывании их с различными мембранными структурами?
8. Опишите физико-химические методы модификации биомембран.
9. Почему фосфолипазы относят к химическим модификаторам биомембран?
10. На каком основании каталазу относят к антиоксидантным ферментам?
11. Какие функции в клетке выполняет глутатионредуктаза?
12. Какие методы используют для обнаружения и доказательства фактов участия активных форм кислорода в УФ-превращениях биомакромолекул? Каковы их преимущества и недостатки?
СПИСОК ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Алберте Б., Брей Д., Льис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. — М.: Мир, 1994. — Т. 1. — 517 с.
Актонов В. Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. — М.: Наука, 1982. — 151 с.
Артюхов В. Г., Башарина О. В., Вашанов Г. А., Наквасина М. А., Путинцева О. В. Олигомерные белки: структурно-функциональные модификации и роль субъединичных контактов. — Воронеж: Изд-во ВГУ, 1997. — 264 с.
Артюхов В. Г., Ковалева Т. А., Шмелев В. П. Биофизика: Учебное пособие. — Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. — 336 с.
Артюхов В. Г., Путинцева О. В. Оптические методы анализа ин-тактных и модифицированных биологических систем. — Воронеж: Изд-во ВГУ, 1996. — 240 с.
Биологические мембраны. Методы/ Под ред. Дж. Б. Финдлея, У. Г. Эванза. — М.: Мир, 1990. — 424 с.
Биофизика: Учебник/ Под ред. П. Г. Костюка. — Киев: Выща шк.,
1988. — 504 с.
Биохимическое исследование мембран / Под ред. Э. Мэдди. — М.: Мир, 1979. — 460 с.
